Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie pojedynczego pęcherzyka, cytozy i endocytozy. Osiąga się to poprzez uprzednie uzyskanie czystego i całkowitego trawienia tkanki nadnerczy myszy. Drugim krokiem jest dysocjacja i płytka komórek z nadnerczy.

Następnie komórki chrominowe są identyfikowane i zaciskane w celu uzyskania zapisów pojemności przyłączonej do ogniwa. Ostatecznie można zaobserwować pojedynczy pęcherzyk, cytozę i endocytozę. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zapisy pojedynczych kanałów jonowych przyłączonych do komórek, jest to, że jesteśmy w stanie wykryć egzocytozę i endocytozę pojedynczych pęcherzyków.

Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ uzyskanie giga pieczęci jest trudne do nauczenia. Ponadto identyfikacja komórek wśród mieszanych typów komórek znajdujących się na płytce może być trudna. Aby przygotować się do operacji, zacznij od autoklawowania pary dużych i małych preparacji, nożyczek i dwóch par kleszczy.

Następnie umieść tacę preparacyjną na wiaderku z lodem. Zacznij również bulgotać roztwór enzymatyczny z 5% dwutlenkiem węgla i 95% tlenem. Roztwór jest jasnoróżowy przed bulgotaniem. Następny.

Po eutanazji i odcięciu głowy nowonarodzonemu lub trzydniowemu myszowi, użyj mniejszego zestawu nożyczek, aby odciąć tył szczeniaka wzdłuż kręgosłupa od odcinka szyjnego do rdzeniowego. Pamiętaj, aby ciąć powierzchownie pod skórą, aby uniknąć przekłucia jamy ciała. Następnie oderwij skórę od kręgosłupa, aby mięśnie były odsłonięte i był wyraźny widok kręgosłupa.

Teraz wykonaj cięcie w przekroju poprzecznym w odcinku szyjnym rdzenia kręgowego, a następnie wykonaj dwa równoległe cięcia wzdłuż boków kręgosłupa jedną parą kleszczy przytrzymujących główne ciało zwierzęcia. Użyj drugiej pary kleszczy, aby chwycić kręgosłup i odklej kręgosłup, aż nerki zostaną odsłonięte. Po zlokalizowaniu nadnerczy na nerkach użyj kleszczy, aby je usunąć.

Następnie ostrożnie umieść nadnercza w stożkowej rurce wypełnionej roztworem zamka. Użyj drugiej pary kleszczy, aby usunąć nadnercza. Jeśli przykleją się do pierwszej pary kleszczy, umieść stożkową rurkę na lodzie.

Gruczoły mogą być przechowywane w roztworze śluzy do dwóch godzin. W tym momencie sprawdź roztwór enzymu, aby upewnić się, że zrównoważony roztwór zmienił kolor z jasnoróżowego na różowawo-pomarańczowy. Następnie dodaj pape do świeżo bąbelkowego roztworu enzymu o końcowym stężeniu od 20 do 25 jednostek na mililitr.

Następnie dodaj roztwór enzymu propanowego do nowej stożkowej rurki i za pomocą kleszczy przenieś nadnercza do rurki enzymatycznej propanu. Inkubuj gruczoły przez 40 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 75% roztworu inaktywacyjnego do każdej probówki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 10 minut.

Po 10 minutach delikatnie przenieś gruczoły do nowo oznakowanej probówki i umyj gruczoły trzykrotnie pożywką hodowlaną. Po umyciu umieść gruczoły w 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej, a następnie delikatnie miareczkuj gruczoły w górę iw dół przez końcówkę pipety pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Podczas miareczkowania utrzymuj gruczoły na dnie probówki z siłą skierowaną w dół z końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i delikatnie i powoli dotykaj tkanki Pamiętaj, aby używać powolnych, ciągłych pociągnięć, nigdy nie pipetując szybko lub gwałtownie Po miareczkowaniu dodaj dodatkowe 250 mikrolitrów pożywki hodowlanej, aby zwiększyć całkowitą objętość pożywki hodowlanej do 450 mikrolitrów.

Na następnym miejscu znajduje się siedem 12-milimetrowych wstępnie powlekanych szkiełek nakrywkowych PDL w płytce do hodowli o wymiarach 60 na 50 milimetrów. Następnie rozlać 60 mikrolitrów roztworu komórki na każde z siedmiu szkiełek nakrywkowych. Po platerowaniu umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut.

Po inkubacji delikatnie dodaj pięć mililitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do naczynia hodowlanego, a następnie inkubuj przez 24 godziny przed wykonaniem nagrań z dołączonymi komórkami. Po miejscu inkubacji 12-milimetrowy szkiełko nakrywkowe zawierające komórki nadnerczy do roztworu zewnątrzkomórkowego. Ponieważ wykorzystano całe nadnercza, następnym krokiem jest różnicowanie komórek chrominy i komórek korowych.

W hodowli komórki chrominy są zazwyczaj bardzo jasne z brązowawo-beżowym zabarwieniem i prawie idealną okrągłą formą. Natomiast komórki korowe są mniejsze i ciemniejsze niż komórki CHRO. Po wyciągnięciu pipet z plastrem zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zanurz końcówkę pipety w stopionym wosku, aby zmniejszyć pojemność szkła.

Następnie wypoleruj końcówkę ogniem, aby zdmuchnąć ten wosk z wnętrza końcówki pipety. Następnie zbuduj pipetę z roztworem pipety z plastrem tak, aby jej rezystancja wynosiła około dwóch megaomów. Przymocuj pipetę z plastrem do manipulatora i umieść ją w odległości kilku mikronów od komórki.

Kontynuuj przesuwanie pipety, szukając niewielkich deformacji komórek. Po zauważeniu deformacji zastosuj delikatne ssanie, aż do uzyskania giga om uszczelnienia. Uzyskanie konfiguracji dołączonej komórki.

Po ujawnieniu uszczelki giga om wykonaj nagrania podłączone do komórki za pomocą wzmacniacza EPC seven plus patch clamp amplifier i dwufazowego analogowego wzmacniacza lock-in, jak opisano w protokole tekstowym, ustaw fazę wzmacniacza lock-in tak, aby przejściowa pojemność zmieniała się w wyniku delikatnego ssania. Impulsy pojawiają się tylko w pojemności łaty lub ślad Im bez projekcji do łaty, przewodzenia lub śledzenia procesu łatania służy jako stymulacja mechaniczna. Ponieważ prąd działania można zwykle rejestrować z większości ogniw, typowe zmiany pojemności można zidentyfikować za pomocą zaznaczonego kroku w dół.

Ostatnim krokiem jest zapisanie danych do przyszłej analizy. Pokazano tutaj typowy zapis pojemnościowy z dołączoną komórką z wieloma krokami w dół. Każdy krok w dół wiąże się z pojedynczą endocytozą iCal.

Po opanowaniu hodowla komórkowa może zostać zakończona w ciągu dwóch do trzech godzin, a nagrania można wykonać w ciągu kolejnych czterech dni po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transmisją synaptyczną do zbadania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w neuroendokrynnych komórkach chrominy.