Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oznaczenie stężenia wirusa poprzez kwantyfikację zakaźnych wirionów za pomocą liczenia pojedynczych plaques w hodowli komórkowej. Jest to realizowane poprzez uprzednie wysianie komórek w celu utworzenia konfluentnej warstwy jednowarstwowej do infekcji. Drugim krokiem jest wykonanie rozcieńczeń seryjnych nieznanej próbki wirusa poddawanej kwantyfikacji. Następnie konfluentne warstwy jednowarstwowe są infekowane z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych zapasu wirusa, a następnie nakładana jest unieruchamiająca warstwa overlay. Ostatnim krokiem jest utrwalenie i barwienie plaques po odpowiednim czasie inkubacji dla danego wirusa w celu policzenia pojedynczych plaques. W ostateczności testy plaque mogą być stosowane i modyfikowane na wiele różnych sposobów w celu oznaczenia miana wirusa w nieznanej próbce wirusowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakładka półstała, jest znacznie prostsze nakładanie i usuwanie warstwy zarówno w zastosowaniach wysokoprzepustowych, jak i tradycyjnych. Dodatkowo nie jest wymagane podgrzewanie odczynników. Zastosowanie tej techniki znajduje odzwierciedlenie w badaniach nad wieloma różnymi wirusami litycznymi, ponieważ użycie nakładki ciekłej w formacie 96-dołkowym umożliwia szybki screening nowych związków terapeutycznych, co może znacznie skrócić czas spędzany w laboratorium na wykonywaniu tradycyjnych testów płytek.

Na dzień przed przeprowadzeniem testu należy wysiać odpowiednie komórki dla badanego wirusa, aby w dniu infekcji osiągnęły one od 90 do 100% konfluencji. Roztwory stokowe można również przygotować dzień przed testem. Najpierw należy przygotować roztwór utrwalający składający się z 10% formaldehydu w wodzie destylowanej, mieszając 5,56 milliliters 36% roztworu stokowego formaldehydu z 14,44 milliliters wody destylowanej. Następnie należy przygotować barwnik fioletem krystalicznym, składający się z 1% fioletu krystalicznego w 20% etanolu rozcieńczonego wodą destylowaną. W kolejnym kroku, pracując w warunkach sterylnych, należy przygotować odpowiednią pożywkę do testu plackowego 2x dla stosowanego typu komórek. Jeśli którykolwiek z odczynników nie jest sterylny, roztwór należy przefiltrować przez filtr 0,2 micron. Aby przygotować ciekłą warstwę nakładkową do testu plackowego, należy dodać 2,4 grams Avicel do kolby zawierającej 97,6 milliliters wody destylowanej, intensywnie mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Roztwór należy mieszać w temperaturze pokojowej, aż stanie się zbyt lepki dla mieszadła. W tym momencie kolbę należy przenieść na wytrząsarkę do kolb i intensywnie wstrząsać przez 30 minutes, aby zapewnić równomierną homogenizację. Na koniec roztwór należy wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121 degrees Celsius przy ciśnieniu 14 PSI przez 30 minutes.

Po zakończeniu programu przechowywać szczelnie zamknięte w temperaturze pokojowej. W celu przygotowania warstwy agarozy, sporządzić 0.6% roztwór stokowy agarozy w wodzie destylowanej, wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego i autoklawować do całkowitego rozpuszczenia. W celu przygotowania warstwy karboksymetylocelulozy, sporządzić 2% roztwór karboksymetylocelulozy w wodzie destylowanej i wymieszać. Następnie autoklawować w ten sam sposób co wcześniej.

Dzień po wysianiu komórek, przed rozpoczęciem analizy, należy sprawdzić ich konfluencję i żywotność za pomocą mikroskopu odwróconego. Należy upewnić się, że komórki wykazują standardową morfologię i osiągnęły około 90% konfluencji.

Przeprowadź dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne zainfekowanych próbek w pożywce do wzrostu komórek, dostosowując liczbę rozcieńczeń do oczekiwanego miana rozważanego wirusa. Przygotuj również niezinfekowaną próbkę kontrolną, aby niezależnie potwierdzić żywotność komórek i ułatwić identyfikację placków. Pipetuj próbkę kontrolną oraz rozcieńczenia seryjne do studzienek płytki, uważając, aby nie uszkodzić monowarstwy.

Należy użyć wystarczającej objętości inokulum, aby przykryć komórki, utrzymując jednocześnie objętość na jak najniższym poziomie, aby zmaksymalizować kontakt wirusa z monowarstwą. Płytki należy umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek i inkubować w celu zainfekowania komórek przez okres od 45 minut do jednej godziny. Co 20 minut należy delikatnie kołysać płytkami, aby zapewnić równomierne pokrycie i zapobiec wysychaniu monowarstwy komórkowej.

Podczas zakażania należy przygotować roboczy roztwór warstwy nadlewkowej do nadlewek płynnych. Wymieszaj ocieplone podłoże do płytkowania i roztwór stokowy Avicel o stężeniu 1,2 do 2,4% w temperaturze pokojowej w stosunku jeden do jednego, aby uzyskać roboczy roztwór podłoża nadlewkowego Avicel o stężeniu 0,6 do 1,2%. W przypadku nadlewek z agarozy lub CMC wymieszaj ocieplone podłoże do płytkowania oraz roztwór stokowy podgrzanej 0,6% agarozy lub 2% CMC w stosunku jeden do jednego. Następnie umieść roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C na 30 minut w celu wyrównania temperatury. Upewnij się, że roztwór jest ciepły, ale nie gorący w dotyku, aby zapobiec śmierci komórek i obniżeniu miana wirusa. Po zakażaniu nanieś nadlewki na zakażone monowarstwy. Po dodaniu nadlewki inkubuj płytki w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez okres od 2 do 14 dni, w zależności od analizowanego wirusa.

Aby utrwalić komórki przy zastosowaniu warstwy ciekłej, należy odlać lub odessać warstwę Avicel, a następnie pipetować 10% roztwór formaldehydu do dołków i utrwalać w temperaturze pokojowej od 30 minut do całej nocy. W przypadku agarozy lub CMC należy dodać roztwór formaldehydu bezpośrednio do warstwy wierzchniej i inkubować od jednej godziny do całej nocy w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu należy usunąć formaldehyd, a następnie ręcznie usunąć półstałe zatyczki z agarozy za pomocą szpatułki.

Opłucz płytki z komórkami Avicel wodą w celu usunięcia pozostałości utrwalacza warstwy nakładkowej przed barwieniem.

Aby przeprowadzić barwienie, pokryj komórki minimalną ilością roztworu fioletu krystalicznego na około 15 minut. W razie potrzeby kołysz płytkami, aby zapewnić równomierne pokrycie. Ostrożnie wypłucz barwnik fiolet krystaliczny wodą. Po utrwaleniu, zabarwieniu i wysuszeniu płytki można przechowywać w nieskończoność do późniejszej analizy. Policz płytki w każdej studni, pomijając te, w których znajduje się mniej niż pięć lub więcej niż 100 płytek. Wyciągnij średnią dla powtórzeń technicznych tego samego rozcieńczenia. Zwróć uwagę na wielkość i morfologię płytek. Wyznacz miano wirusa w próbce zapasowej, przyjmując średnią liczbę płytek dla danego rozcieńczenia oraz odwrotność całkowitego współczynnika rozcieńczenia.

Na tym obrazie przedstawiono porównania nakładek do oznaczania placków wirusa gorączki doliny Rift z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych. Komórki Vero wysiano w liczbie 2,5 × 10⁵ na dołek w płytkach 12-dołkowych i zainfekowano 200 µL tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej MP 12. Po infekcji naniesiono 1,5 ml nakładek z 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC w celu bezpośredniego porównania nakładek. Ten histogram przedstawia wyniki zliczania placków i miareczkowania dla wszystkich trzech nakładek. Tutaj pokazano porównania nakładek do oznaczania placków VEEV z wykorzystaniem płytek 12-dołkowych. Komórki Vero wysiano jak wcześniej i zainfekowano objętością 200 µL tej samej seryjnie rozcieńczonej próbki wyjściowej szczepu szczepionkowego VEEV-TC 83; po infekcji naniesiono 1,5 ml nakładek z 0,3% agarozy, 0,6% Avicel lub 1% CMC w sposób opisany wcześniej.

Ponownie, histogram przedstawia wyniki zliczania placków i miareczkowania dla wszystkich trzech nakładek. Obraz ten pokazuje przykład wysokoprzepustowych nakładek do wykrywania placków. Płytkę 96-dołkową z komórkami Vero, wysianymi w zagęszczeniu 3 × 10⁴ komórek na dołek, zainfekowano 50 µL inokulum, wykorzystując tę samą próbkę startową wirusa gorączki doliny Rift MP 12 poddaną rozcieńczeniom seryjnym, przez jedną godzinę w czterech powtórzeniach. W przypadku nakładek przetestowano końcowe stężenia Avicel wynoszące 0,6% i 1,2%, aby określić wykonalność i powtarzalność stosowania nakładek ciekłych w sposób wysokoprzepustowy. Przedstawiony histogram pokazuje miana określone dla każdej nakładki.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każdy wirus jest inny i konieczne może być wprowadzenie optymalizacji, w tym zastosowanie innych typów komórek, czasów inkubacji lub pożywek wzrostowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić podstawowy test plackowy z wykorzystaniem nakładek płynnych i półstałych.