Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc
6 stycznia 2015
Opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy i pokazujemy, że jest ona wystarczająco wrażliwa na zmiany fenotypu w wielu powszechnych patologiach płuc. Metryka ta ma zatem bezpośrednie znaczenie translacyjne dla modeli mysich, ponieważ zdolność dyfuzji można również łatwo zmierzyć u ludzi.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nauczenie się, jak mierzyć zdolność dyfuzyjną płuc myszy za pomocą skalibrowanego chromatografu gazowego. Osiąga się to poprzez napompowanie płuc znieczulonej myszy gazem zawierającym neon i tlenek węgla, zatrzymanie gazu w płucach przez dziewięć sekund i zebranie gazu. Gaz pobrany z płuc jest następnie rozcieńczany do dwóch mililitrów i wstrzykiwany do chromatografu gazowego.
Zróżnicowany wychwyt neonu i tlenku węgla w płucach służy do obliczenia zdolności dyfuzyjnej. Pomiar ten może być wykorzystany do oceny utraty funkcji płuc w szerokim spektrum modeli chorób płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu ze wszystkimi innymi istniejącymi metodami pomiaru czynności płuc u myszy jest to, że jest to bardzo prosty, powtarzalny pomiar, który można bezpośrednio porównać z podobnymi pomiarami u ludzi.
Metoda ta może być stosowana do śledzenia zmian w strukturze płuc, które występują w przypadku różnych patologii płuc. Protokół ten rozpoczyna się od skonfigurowania modułu chromatografu gazowego dostarczonego z maszyną do pomiaru pików azotu, tlenu, neonu i tlenku węgla. Do tego zastosowania potrzebne są tylko dane dotyczące neonu i tlenku węgla.
Przyrząd wykorzystuje kolumnę z sitem molekularnym z helem jako gazem nośnym. Ten konkretny chromatograf gazowy ma kolumnę o pojemności 0,8 mililitra, a próbka o pojemności dwóch mililitrów jest używana w celu zapewnienia odpowiedniego oczyszczenia tej kolumny przed rozpoczęciem. Seria pomiarów zawsze kalibruje maszynę przy użyciu dwóch mililitrów gazu bezpośrednio z worka na próbkę gazu.
Pierwszym pikiem, który się pojawia, jest neon, następnie tlen i azot, których nie mierzymy w tej procedurze. Wreszcie pik tlenku węgla pojawia się czas chromatografu gazowego. Zmierzenie wszystkich tych szczytów zajmuje niecałą minutę.
Na początek znieczulij myszy ketaminą i ksylazyną. Potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego w odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi. Następnie, aby chronić oczy, nałóż maść weterynaryjną, a następnie tracheostomię myszy za pomocą kaniuli studen.
Użyj kaniuli o rozmiarze 18 dla dorosłych lub kaniuli o rozmiarze 20 dla bardzo młodych myszy. Następnie uruchom metronom ze słyszalnymi kliknięciami co sekundę. W przypadku myszy starszych niż sześć tygodni użyj trzymililitrowej strzykawki, aby pobrać 0,8 mililitra gazu z worka z mieszanką gazów.
Jeśli mysz ma mniej niż cztery tygodnie, użyj 0,4 mililitra gazu, a następnie podłącz strzykawkę do kaniuli tchawicy i szybko napompuj płuca. Zacznij liczyć w myślach od jednego do 10 synchronicznie z kliknięciami metronomu. Gdy liczba osiągnie 10, szybko wycofaj objętość 0,8 mililitra.
Rozcieńczyć ten wydychany gaz do dwóch mililitrów, dodając pomieszczenie, powietrze i wagę przez co najmniej 15 sekund. Bardzo ważne jest, aby napompować i opróżnić płuca tak szybko, jak to możliwe. Szybkie napompowanie jest bardzo łatwe, ale wymaga trochę praktyki, aby szybko pobrać 0,8 ml, a następnie wstrzyknąć całą próbkę do chromatografu gazowego.
W przypadku analizy ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia próbki podczas przenoszenia do i od zwierzęcia oraz do chromatografu gazowego. Można to zrobić ostrożnie, zakrywając znak palcem Podczas gdy GC mierzy próbkę. Napompuj płuco myszy kolejnym 0,8 mililitra mieszaniny gazów z torby, a następnie przetwórz tę próbkę identycznie jak pierwszą.
Korzystając ze średnich wartości z dwóch pomiarów, oblicz DFCO. Indeks dolny C odnosi się do gazów kalibracyjnych, a indeks dolny dziewięć odnosi się do próbek pobranych od zwierzęcia. Po dziewięciosekundowym wstrzymaniu oddechu.
Nominalna kontrolna wartość DFCO pobrana z czarnych sześciu myszy C 57 wynosi około 0,77. W badaniu z zastosowaniem modelu grypy PR 8 zaobserwowano postępującą utratę funkcji w szóstym i ósmym dniu w modelu rozedmy płuc 21 dni po instalacji elastazy. DFCO było umiarkowanie obniżone, ale zaobserwowano znacznie większe zmiany w modelu zwłóknienia wywołanego instalacją Blio Mycin.
Szlak zwłóknienia spowodowany przez bleomycynę spowodował największą zmianę DFCO zaobserwowaną w jakimkolwiek z modeli patologicznych. Jest to ważne, ponieważ zdolność dyfuzji jest również wiarygodnym markerem zwłóknienia u ludzi. Gen CFTR odgrywa kluczową rolę w mukowiscydozie, a w badaniu myszy pozbawionych tego genu nastąpił znaczny spadek DFCO.
DFCO zostało dodatkowo zmniejszone w przypadku infekcji grzybiczej u tych myszy z nokautem. Powszechnie stosowanym modelem urazu płuc jest LPS. U myszy narażonych na LPS nastąpiła postępująca zależna od czasu utrata funkcji płuc od pierwszego do czwartego dnia, co oceniano za pomocą pomiarów DFCO, pomiar DFCO można z powodzeniem wykonać u myszy w wieku dwóch tygodni
.Mniejszy rozmiar płuca wymaga mniejszej objętości napompowania wynoszącej 0,4 mililitra. DFCO mierzone przy tej mniejszej objętości jest w stanie wykazać oczekiwany wzrost w miarę dojrzewania płuc po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w ciągu zaledwie kilku minut na mysz przed wykonaniem jakichkolwiek innych pomiarów lub ocen funkcji płuc.
Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że etap napełniania i opróżniania został wykonany szybko oraz aby zachować ostrożność podczas przenoszenia próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy z wykorzystaniem skalibrowanego chromatografu gazowego. Technika ta jest czuła na zmiany fenotypowe w różnych patologiach płuc, co czyni ją istotną w badaniach translacyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Fizjologia układu oddechowego
- Badania translacyjne
Wstęp
- Zdolność dyfuzyjna płuc jest kluczowym miernikiem funkcji płuc.
- Istniejące metody pomiaru funkcji płuc u myszy mogą być złożone.
- Badania porównawcze między myszami a ludźmi są niezbędne dla istotności translacyjnej.
- Do prowadzenia efektywnych badań niezbędne są proste i powtarzalne techniki.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy.
- Ocena utraty funkcji płuc w różnych modelach chorób płuc.
- Ułatwienie porównań pomiarów funkcji płuc pomiędzy myszami a ludźmi.
Zastosowane metody
- Napowietrzanie płuc znieczulonej myszy mieszaniną gazów zawierającą neon i tlenek węgla.
- Utrzymywanie gazu w płucach przez dziewięć sekund przed jego pobraniem.
- Rozcieńczenie pobranego gazu do 2 mL w celu przeprowadzenia analizy.
- Wykorzystanie chromatografu gazowego do pomiaru różnicowego poboru gazów.
Główne wyniki
- Metoda ta zapewnia niezawodny pomiar zdolności dyfuzyjnej płuc.
- Jest ona czuła na zmiany funkcji płuc związane z różnymi patologiami.
- Technika ta jest prosta i powtarzalna, co zwiększa jej zastosowanie w badaniach.
- Wyniki można bezpośrednio porównać z analogicznymi pomiarami u ludzi.
Wnioski
- Metoda ta stanowi wartościowe narzędzie do oceny funkcji płuc w modelach mysich.
- Wspiera ona badania translacyjne, umożliwiając zestawienie pomiarów dokonywanych u myszy i ludzi.
- W przyszłych badaniach technika ta może zostać wykorzystana do bardziej efektywnego zgłębiania patologii płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar pojemności dyfuzyjnej płuc u myszy stanowi translacyjną próbę czynnościową płuc, która umożliwia bezpośrednie porównanie z klinicznymi danymi ludzkimi. Podejście to wspiera charakteryzację fenotypową modeli chorób płuc i zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznej walidacji celów terapeutycznych. Prostota i powtarzalność tej metody ułatwiają jej integrację z procesami badawczymi w celu mechanistycznej redukcji ryzyka oraz selekcji projektów w portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie utraty funkcji płuc w modelach rozedmy, włóknienia, ostrego uszkodzenia płuc oraz infekcji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybki i powtarzalny test do walidacji funkcjonalnej celów terapeutycznych w badaniach nad patologią płuc u myszy.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Dostarcza ilościowych odczytów opartych na wymianie gazowej, odpowiednich do przesiewowego badania wpływu związków na strukturę i funkcję płuc.
- Wartość operacyjna: Znormalizowana procedura z odczytem trwającym mniej niż 1 minutę wspiera wysokoprzepustowe przesiewy fenotypowe w procesach odkrywania leków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodna z pomiarami zdolności dyfuzyjnej u ludzi, co umożliwia dopasowanie biomarkerów międzygatunkowych i zapewnia ciągłość translacyjną.
- Wartość operacyjna: Wspiera decyzje o kontynuowaniu badań w oparciu o analizę ryzyka poprzez wykrywanie wczesnych zmian funkcjonalnych w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, stanowiąc pomost fenotypowy między modelami mysimi a klinicznymi punktami końcowymi u ludzi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez wykrywanie strukturalnych zmian w płucach za pomocą funkcjonalnych parametrów wymiany gazowej.
- Przesiew: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanemu poborowi gazów oraz analizie chromatograficznej poboru neonu i tlenku węgla.
- Analityka: Generuje ilościowe wartości pojemności dyfuzyjnej (DFCO), które pozwalają na porównanie funkcji płuc w różnych warunkach eksperymentalnych i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy mysie z istotnością kliniczną u ludzi poprzez bezpośrednią porównywalność pomiarów pojemności dyfuzyjnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi możliwość ponownego wykorzystania w ramach podłużnego monitorowania funkcji płuc w wielu modelach chorób i fazach badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w modelach patologii płuc dzięki ilościowemu fenotypowaniu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki szybkiemu przepływowi pracy obejmującemu wtrysk gazu, wstrzymanie oddechu oraz analizę GC.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając wczesnych, istotnych translacyjnie odczytów funkcjonalnych, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków w oparciu o ryzyko, bazując na zachowaniu lub poprawie funkcji płuc w modelach chorobowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie znieczulania myszy, kaniulacji tchawicy oraz technik obsługi gazów.
- Zależne od dostępu do skalibrowanego chromatografu gazowego z kolumną z sita molekularnego i helem jako gazem nośnym.
- Wymaga standaryzacji objętości gazów, czasu nadmuchiwania oraz protokołów rozcieńczania próbek pomiędzy zespołami.
- Obejmuje kwestie adaptacji dla myszy noworodkowych w porównaniu z dorosłymi ze względu na wielkość płuc i wymagane objętości gazu (0.4 mL vs. 0.8 mL).
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność zapobiegania zanieczyszczeniu próbek podczas przenoszenia oraz znaczenie szybkiego nadmuchiwania i wypuszczania powietrza z płuc dla uzyskania dokładnych pomiarów.
