Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji
24 lutego 2015
Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.
Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie metylacji CPG w docelowych regionach zainteresowania z genomowego DNA, wyizolowanego z tkanki lub komórek będących przedmiotem zainteresowania. Osiąga się to poprzez pierwsze zaprojektowanie starterów PCR specyficznych dla siarczynów w celu amplifikacji obszarów zainteresowania z genomowego DNA przekształconego przez bisiarczyny. W drugim kroku amplifikowany jest obszar zainteresowania przekształcony w bi-siarczyn, a z konspektów amplikonów generowane są biblioteki sekwencjonowania nowej generacji lub NGS.
Następnie biblioteki są sekwencjonowane i generowane są pliki FASTQ do analizy. W ostatnim kroku odczyty sekwencjonowania są dopasowywane do referencyjnej sekwencji docelowej przekształconej przez bi-siarczyn, a pięć procent mc oblicza się ostatecznie za pomocą sekwencjonowania amplikonów siarczynów lub BS można przeprowadzić w celu precyzyjnego i dokładnego ilościowego określenia metylacji CPG w dowolnym regionie zainteresowania z dowolnego organizmu modelowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie Sangera, jest to, że BS A S zapewnia dokładną i precyzyjną kwantyfikację metylacji CPG w szybki sposób o wysokiej przepustowości, zapewniając możliwość oznaczania wielu regionów w dużej liczbie próbek.
Po zidentyfikowaniu celu i zaprojektowaniu startera, zmontuj reakcję w celu optymalizacji amplifikacji docelowej pojedynczego amplikonu, a następnie uszczelnij płytkę PCR folią zgrzewaną, aby uwidocznić amplikony za pomocą elektroforezy stronicowej. Następnie załaduj odpowiednie studzienki 30 mikrolitrami reakcji PCR lub drabiny, a następnie uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez około 45 minut. Gdy pierwszy barwnik dotrze do końca żelu, należy zatrzymać reakcję, a następnie pokryć cały żel pięcioma mikrogramami na mililitr świeżo przygotowanego bromku AUM.
Po pięciu minutach zobrazuj żel za pomocą transluminatora UV o długości fali wzbudzenia 482 nanometrów. Użyj drabinki, aby zwymiarować amplikony PCR, aby określić swoistość reakcji. Poszukaj wielu pasm innych niż oczekiwany rozmiar amplikonu, aby określić średni rozmiar wykrytych pików biblioteki i oszacowanie molowości.
Następnie uruchom biblioteki na chipie do wymiarowania DNA do elektroforezy kapilarnej z testem DNA o wysokiej czułości zgodnie z instrukcjami producenta. Aby określić ilościowo biblioteki za pomocą QPCR. Używaj starterów zaprojektowanych dla sekwencji adapterów w wygenerowanych bibliotekach i standardach o znanym stężeniu na instrumencie czasu rzeczywistego, używając bezwzględnych ustawień kwantyfikacji zgodnie z instrukcjami producenta.
Następnie użyj rozmiaru bibliotek i ilościowej ilości molowców z QPCR, aby obliczyć stężenia molowe bibliotek. Po sekwencjonowaniu zaimportuj spakowane szybkie pliki Q do odpowiedniego potoku analizy sekwencjonowania, wybierz opcję importuj, a następnie wybierz metodę sekwencjonowania używaną do generowania odczytów, aby zachować wyniki Q dla aplikacji do przycinania odczytu. Zaimportuj odpowiednie spakowane pliki szybkiego odczytu Q, a następnie w obszarze Opcje ogólne usuń zaznaczenie opcji Odrzuć wyniki jakości.
Wybierz lokalizację importowanych odczytów i kliknij przycisk Zakończ. Następnie w obszarze Narzędzia podstawowe NGS wybierz sekwencje przycinania. Zaznacz odczyty, które mają zostać przycięte, zachowując tylko te odczyty, które zawierają wyniki większe lub równe Q 30.
Następnie wybierz przycinanie za pomocą wyników jakości i ustaw limit na 0,001. Aby dalej wybierać tylko stroiki zawierające mniej lub równe jednemu niejednoznacznemu nukleotydowi. Wybierz opcję Przytnij niejednoznaczne nukleotydy i ustaw maksymalną liczbę niejednoznaczności na jeden.
Następnie wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać przycięte odczyty, i kliknij przycisk Zakończ, aby zmapować przyciętą res do odniesienia do genu in silico przez konwersję siarczynów. W obszarze Narzędzia podstawowe NGS wybierz pozycję odczyty mapy. Aby się odwołać, wybierz przycięte odczyty, które mają zostać zmapowane, a następnie kliknij przycisk Dalej.
Następnie w obszarze Maskowanie odwołań wybierz przekonwertowaną sekwencję odwołań i wybierz opcję Brak maskowania. Kliknij przycisk Dalej, a następnie przypisz wynik trzy dla niezgodności, wstawień i usunięć. Przypisz wynik jeden dla minimalnego ułamka mapy długości odczytu do odwołania i przypisz wynik 0,9 dla minimalnego ułamka tożsamości między mapą, odczytem i odwołaniem w obszarze obsługi dopasowań niespecyficznych, wybierz, zignoruj i kliknij przycisk Dalej w obszarze opcji wyjściowych.
Następnie wybierz pozycję Utwórz autonomiczne mapowania odczytu. Następnie w obszarze Obsługa wyników kliknij przycisk Zapisz. Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać mapowanie odczytu, a następnie kliknij przycisk Zakończ, aby uruchomić wariant wywołujący zmapowane odczyty.
W obszarze analiza ponownego sekwencjonowania wybierz wykrywanie wariantu niskiej częstotliwości i wybierz mapowanie odczytu, które ma być analizowane. Kliknij Dalej, a następnie w polu Parametr wariantu niskiej częstotliwości wprowadź 0,01% i kliknij Dalej. W obszarze filtry ogólne ustaw minimalne pokrycie na 1000, aby upewnić się, że sekwencja znajduje się na głębokości większej lub równej 1000 x.
Na koniec kliknij przycisk Dalej, a następnie w obszarze Opcje wyjściowe wybierz opcję Utwórz tabelę z adnotacjami i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik tabeli wariantów, kliknij przycisk Zakończ i użyj częstości wariantów w miejscach CPG z adnotacjami w regionie zainteresowania z pliku tabeli wariantów, aby obliczyć częstość metylacji cytozyny w cytozynie referencyjnej w kontekście CG przez sekwencjonowanie amplikonów siarczynowych, odczyty prawidłowo wyrównane do przekonwertowanej sekwencji referencyjnej będą podobne do zilustrowanych na rysunku. Dinukleotydy CPG można wyraźnie zidentyfikować, a stany metylacji można oszacować, obserwując wywołania zasad w miejscach CPG. W zmapowanych odczytach 0% metylacji spowoduje zmapowane odczyty zawierające tyminę zmapowaną do miejsc CPG.
100% kontrola metylacji spowoduje zmapowanie odczytów zawierających cytozyny zmapowane do miejsc CPG. W tym eksperymencie RNA i DNA zostały wspólnie wyizolowane z myszy, móżdżku i siatkówki. Ekspresję opsyny selektywnie wyrażaną w tkance siatkówki mierzono następnie za pomocą QPCR zgodnie z oczekiwaniami
.RNA opsyny wykryto tylko w siatkówce po ilościowym określeniu poziomów metylacji CPG w regionie promotora opsyny za pomocą sekwencjonowania amplifikacji bisiarczynów. Jednak skumulowane poziomy metylacji w całym regionie promotora były większe niż 80% w móżdżku w porównaniu do mniej niż 15% w siatkówce. Kwantyfikacja metylacji B SAS korzysta z kwantyfikacji metylacji specyficznej dla miejsca, umożliwiając porównanie poziomów metylacji na podstawie specyficznej dla CPG w dowolnym regionie genomu.
Rzeczywiście, w tym eksperymencie stwierdzono, że poziomy metylacji CPG w promotorze opsyny są znacznie wyższe w próbkach móżdżku w porównaniu z próbkami siatkówki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo metylację CPG w docelowych regionach zainteresowania z genomowego DNA, wyizolowanego z tkanek lub komórek.
Przegląd
Sekwencjonowanie amplikonów po konwersji pirosiarczynowej (BSAS) jest techniką stosowaną do ilościowego oznaczenia metylacji cytozyny w określonych regionach genomu. Metoda ta łączy konwersję pirosiarczynową z amplifikacją PCR oraz sekwencjonowaniem następnej generacji w celu uzyskania precyzyjnej kwantyfikacji metylacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Biologia molekularna
- Epigenetyka
Wprowadzenie
- BSAS umożliwia analizę wzorców metylacji DNA.
- Jest szczególnie przydatna w badaniu regulacji i ekspresji genów.
- Metoda ta zapewnia wysoką przepustowość przy analizie wielu próbek.
- Oferuje ona przewagę nad tradycyjnymi metodami, takimi jak sekwencjonowanie metodą Sangera.
Cel badania
- W celu dokładnego ilościowego oznaczenia metylacji CPG w wybranych obszarach genomu.
- W celu lepszego zrozumienia regulacji epigenetycznej w różnych kontekstach biologicznych.
- W celu usprawnienia analizy metylacji u różnych organizmów modelowych.
Zastosowane metody
- Projektowanie specyficznych starterów PCR do amplifikacji celu.
- Amplifikacja genomicznego DNA po konwersji pirosiarczynowej.
- Przygotowywanie bibliotek NGS z amplikonów PCR.
- Sekwencjonowanie i analiza otrzymanych plików FASTQ.
Główne wyniki
- Skuteczna kwantyfikacja poziomów metylacji CPG w różnych tkankach.
- Wykazanie różnic w wzorcach metylacji pomiędzy móżdżkiem a siatkówką.
- Przedstawienie wniosków dotyczących regulacji ekspresji opsyn w zależności od stanu metylacji.
- Walidacja dokładności i precyzji metody BSAS w analizie metylacji.
Wnioski
- BSAS jest niezawodną metodą ilościowego oznaczania metylacji DNA.
- Technika ta zwiększa możliwości badania modyfikacji epigenetycznych.
- Posiada ona potencjał do zastosowań w różnych dziedzinach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Celowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania amplikonów po konwersji bisulfitowej (BSAS) odpowiada na zapotrzebowanie na wysokoprzepustowe, ilościowe profilowanie epigenomiczne w początkowej fazie odkrywania leków. Umożliwia ona precyzyjne badanie regulacji epigenetycznej w genomicznych regionach istotnych dla danej choroby, wspierając walidację punktów uchwytu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Metoda ta zapewnia ilościowe oznaczenie metylacji z rozdzielczością do pojedynczej zasady, co pozwala na weryfikację hipotez i selekcję projektów w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów epigenetycznych w promotorach genów docelowych lub wyspach CpG.
- Wartość naukowa: Zapewnia bezwzględne ilościowe oznaczenie metylacji cytozyny z rozdzielczością do pojedynczej zasady w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybką analizę do 96 próbek i 10 kb regionów docelowych w jednym przebiegu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane o metylacji, odpowiednie do standaryzacji testów i oceny powtarzalności.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie bibliotek gotowych do NGS z amplikonów dla skalowalnego, multipleksowego screeningu epigenetycznego.
- Wartość operacyjna: Ułatwia potwierdzenie regionów zidentyfikowanych w badaniach metylacji w całym genomie poprzez walidację celowaną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę systemową istotną dla przebiegu choroby poprzez porównywanie wzorów metylacji w różnych tkankach lub modelach chorobowych.
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez ilościowe określanie metylacji w konkretnych miejscach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia pewność prognostyczną w zakresie minimalizacji ryzyka mechanizmów epigenetycznych przed identyfikacją związku wiodącego.
Integracja potoku i przepływu pracy
BSAS wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu terapeutycznego po identyfikację wiodących związków (lead identification), umożliwiając integrację danych epigenetycznych w kluczowych punktach decyzyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie regulacji epigenetycznej w procesach walidacji celu.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, wysokoprzepustowe odczyty metylacji do porównywania związków lub warunków.
- Analityka: Generuje dane o częstotliwości wariantów w miejscach CpG w celu precyzyjnego obliczenia poziomu metylacji.
- Badania translacyjne: Łączy epigenetykę odkrywczą z ciągłością przedkliniczną poprzez profilowanie metylacji specyficznej dla tkanki.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania ukierunkowanej analizy epigenetycznej w wielu projektach i systemach modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność w walidacji mechanizmów epigenetycznych i redukcja niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność ilościowego oznaczania metylacji w zestawach próbek.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez ograniczanie ryzyka epigenetycznego oraz efektywność kapitałową w wyborze celów.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o walidację epigenetyczną celów istotnych dla choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w konwersji pirosiarczynowej, projektowaniu starterów PCR oraz przygotowywaniu bibliotek NGS.
- Zależy od dostępu do sekwencjonera następnej generacji typu benchtop oraz elektroforezy kapilarnej do kwantyfikacji bibliotek.
- Wymaga standaryzacji potoków bioinformatycznych do trymowania odczytów, mapowania i wywoływania wariantów w ramach współpracy zespołowej.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur do różnych źródeł DNA oraz interesujących badacza regionów genomowych.
- Ograniczona przez konieczność wcześniejszej znajomości regionów docelowych w celu zaprojektowania specyficznych starterów.
FAQ dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Bisulfite Specific PCR Optimization
2:33
Next Generation Sequencing (NGS) Library Preparation, Library Quality Control, and Methylation Quantification Data Analysis
6:29
Results: Representative Methylation Quantification
8:14
Conclusion
