Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie fenotypowych mutacji somatycznych w dehydrogenazie glukozy sześciofosforanowej lub genie G6 PD w komórkach macierzystych okrężnicy. Po leczeniu zwierząt przypuszczalnymi czynnikami genotoksycznymi, osiąga się to poprzez najpierw traktowanie zwierząt środkiem odczekającym odpowiednią ilość czasu, aby umożliwić potomstwu komórki macierzystej niosącej mutację G6 PD pełne zasiedlenie krypty, poświęcenie zwierzęcia, usunięcie okrężnicy i uformowanie jej w szwajcarską bułkę oraz zamrożenie tkanki w ciekłym azocie. Drugim krokiem jest przygotowanie zamrożonych skrawków o grubości siedmiu mikronów na szkiełkach z jelita grubego za pomocą kriostatu.

Tkanka jest podgrzewana do 37 stopni Celsjusza, a następnie wokół skrawków tkanki budowane są studzienki na barwienie tkanki. Ostatnim krokiem jest inkubacja skrawków tkanek z mieszaniną barwiącą G six PD, a następnie analiza skrawków pod mikroskopem świetlnym: komórki z aktywnością G 6 PD zabarwiają się na niebiesko, podczas gdy te z mutacjami fenotypowymi wydają się białawe. Ostatecznie do określenia częstości mutacji stosuje się kwantyfikację zmutowanych cripów.

Technika ta mierzy mutacje somatyczne dehydrogenazy fosforanowej glukozy w komórkach macierzystych i jest to krytyczna populacja komórek w kancerogenezie jelita grubego. Identyfikując mutacje somatycznych komórek macierzystych, możliwe jest powiązanie częstości mutacji z incydentami raka jelita grubego u leczonych zwierząt. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat mutacji komórek macierzystych w okrężnicy, może być również stosowana do innych organizmów modelowych lub układów narządów.

Jeśli można zidentyfikować niszę komórek macierzystych, Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z przygotowaniem roztworu MBT. Solubilizacja. Rozwiązanie MBT wymaga starannego zwrócenia uwagi na szczegółowe instrukcje. Aby rozpocząć przygotowywanie histologicznego roztworu barwiącego o wartości dwóch mililitrów pH 7,4 buforu fosforanowego do 35 mililitrów optymalnej temperatury cięcia lub pożywki OCT w probówce o pojemności 50 mililitrów i energicznie wstrząsnąć, aby połączyć za pomocą bibuły pH.

Potwierdzono, że roztwór ma pH około 7,4. Następnie w glukozie sześć fosforanów i DP oraz roztwór chlorku magnezu rozpuszczono w buforze fosforanowym, jak wskazano w protokole tekstowym, i ponownie potwierdzono, że pH roztworu pozostaje około 7,4. Dodaj roztwór M-M-P-M-S i energicznie wymieszaj.

Powinno to spowodować uzyskanie klarownego, ciemnoczerwonego homogenatu, owiń roztwór w folię, aby zminimalizować ekspozycję na światło. Jeśli roztwór stanie się mętny, należy go wyrzucić podczas podgrzewania kąpieli olejowej. Oddzielnie przygotuj pięciomilimolowy roztwór błękitu nitro do teraz oleum lub MBT, mieszając 0,4 mililitra dimetyloformamidu, 0,4 mililitra bezwodnego etanolu i MBT w dwumililitrowej probówce z pokrywką typu O-ring, luźno zamknij probówkę i doprowadź do energicznego wrzenia w kąpieli olejowej, aż MBT się rozpuści.

Następnie pozwól roztworowi MBT ostygnąć do temperatury pokojowej, a następnie dodaj go do mieszaniny reakcyjnej OCT. Roztwór może z czasem zmienić kolor z początkowego pomarańczowo-czerwonego na ciemnoczerwony lub fioletowy. Po leczeniu zwierząt i przygotowaniu zamrożonych skrawków zgodnie ze wskazaniami w protokole tekstowym, zbuduj studzienki do barwienia tkanek za pomocą dwóch stalowych podkładek połączonych ze sobą smarem silikonowym, dopasuj perfumy do podstawy myjki i wytnij środek, w którym zostanie umieszczony roztwór zastąpiony.

Przed wojną zamrożona tkanka ślizga się w wilgotnym pomieszczeniu o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie umieścić studzienki na szkiełku, aby otoczyć skrawki tkanek około pół mililitra wcześniej przygotowanej mieszaniny barwiącej G 6 PD do każdej studzienki z wycinkiem tkanki i inkubować przez 45 do 50 minut. Wyjmij szkiełka z ciepłego pomieszczenia i ostrożnie wyjmij ze szkiełek ze stali nierdzewnej ze szkiełek.

Umieść szkiełka na dłuższej krawędzi i odcedź mieszaninę mieszaniny reakcyjnej, a następnie przepłucz przez 30 do 60 minut i przygotuj 100-milimolowy bufor fosforanowy. Aby usunąć ostatnie ślady roztworu barwiącego G six PD, płucz szkiełka i dejonizowaną wodę przez pięć do 10 minut, aby usunąć resztki buforu fosforanowego. Na koniec uszczelnij tkankę, dodając kroplami żel fluorowy do szkiełka i susz przez 30 minut, aby uzyskać obrazy do późniejszej analizy.

Umieść szkiełko w mikroskopie świetlnym i ustaw na cztery powiększenia DX. Następnie zrób zdjęcia wybarwionej tkanki za pomocą kamery o rozdzielczości 5,0 megapikseli, aby oszacować całkowitą liczbę badanych krypt. Dla każdej myszy wybierz sekcję z poziomu o najmniejszej powierzchni i zobrazuj ją w powiększeniu 10x.

Policz liczbę zmutowanych cripów. Zgodnie z poniższymi kryteriami cała krypta pozbawiona jest koloru niebieskiego. Zewnętrzna struktura krypty jest nienaruszona.

Mutant jest obserwowany na sąsiednich odcinkach o siedmiu mikronach i dwóch obserwatorach Identyfikuj tę samą kryptę jako mutanta. Wizualnie policz liczbę krypt w tej sekcji i pomnóż przez liczbę poziomów przesiewanych dla każdego dwukropka. Przykłady zmutowanych Crips zaobserwowanych u myszy leczonych czynnikiem uszkadzającym DNA, azoksymetanem, można zobaczyć tutaj po lewej stronie, widać pionowy lub odgórny widok zmutowanej krypty.

Podczas gdy po prawej stronie znajduje się widok poziomy lub boczny, aby krypta została uznana za zmutowaną, wszystkie komórki w krypcie muszą pozostać. Białe krypty z niewielką ilością bieli są spowodowane produkcją śluzu z komórek kubkowych. Częstotliwość mutacji jest obliczana jako liczba zaobserwowanych mutantów podzielona przez całkowitą liczbę krypt, w których nie przebadano żadnego mutanta.

Krępy zaobserwowano w okrężnicy u myszy kontrolnych reprezentujących częstość mutacji mniejszą niż jeden razy 10 do minus piątej, podczas gdy myszy leczone azoksymetanem wykazywały częstość mutacji komórek macierzystych 4,44 razy 10 do minus czterech. Inne metody, takie jak analiza genetyczna rodzaju mutacji dehydrogenazy glukozy x fosforanu, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób czynnik chemiczny błędnie koduje mutację. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć mutacje somatycznych komórek macierzystych u myszy leczonych potencjalnymi związkami mutagennymi i rakotwórczymi.