Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest dokładny pomiar ekspresji genów patogenu in vivo, aby rzucić światło na to, w jaki sposób patogen przystosowuje się do środowiska zakaźnego i powoduje uszkodzenia gospodarza. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zakaźnymi do zbadania dynamiki ekspresji genów patogenów podczas rzeczywistej infekcji na różnych typach tkanek i w wielu punktach czasowych. Główną zaletą tej metody jest to, że jest ona bardzo czuła i niezwykle powtarzalna.

Metoda ta umożliwia ilościowe określenie ekspresji genów patogenu z niewielkiej ilości tkanek pochodzących z rzeczywistej infekcji. Aby rozpocząć przygotowywanie odczynników, dodaj 2-merkaptoetanol do buforu RLT i dobrze wymieszaj. Przygotować mieszaninę roztworu alkoholu fenolowo-chloroformowego i izoamylowego w stosunku 25:24:1.

Oznaczyć probówki homogenizacyjne typu M i schłodzić na lodzie. Oznacz dwie mililitrowe tubki z nakrętką i dodaj około 300 mikrolitrów kulek cyrkonu do każdej tubki. Przygotuj następujące przyrządy do użycia, w tym dysocjator tkanek, ubijak do kulek, wirówkę stołową z adapterami do 50-mililitrowych probówek i 96-dołkowych płytek oraz fotometr.

Wyjmij wcześniej zamrożone nerki wyizolowane od myszy zakażonych C.albicans z zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza i połóż na lodzie. Dodaj 1,2 mililitra buforu RLT do każdej nerki. Następnie zdekantować każdą nerkę z buforem do probówki homogenizacyjnej typu M.

Ilość użytego bufora RLT jest określana empirycznie. Zbyt duża ilość buforu RLT rozcieńczy stężenie próbki, podczas gdy zbyt mała ilość sprawi, że homogenat będzie bardzo lepki i niezwykle trudny w obsłudze. Następnie, używając dysocjatora tkankowego na wstępnie załadowanym ustawieniu RNA 2.01, homogenizuj nerki.

Następnie odwirować przy 1000 x G przez jedną minutę. Przenieś 600 mikrolitrów każdego homogenatu do zakręcanej rurki zawierającej kulki cyrkonu i zachowaj pozostały homogenat na lodzie. Dodaj 600 mikrolitrów fenolowo-chloroformowego alkoholu izoamylowego do każdej probówki, szczelnie zamknij pokrywki i wiruj na ubijaku do kulek przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wirować w temperaturze 15 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie przenieś fazę wodną do nowej 1,5-mililitrowej probówki do mikrofugi, dodając równą objętość 70% etanolu. Następnie załaduj na kolumnę wirującą i wiruj z prędkością 8 000 x G. Przy 700 mikrolitrach buforu RW umyj każdą kolumnę wirową raz, a następnie dwa razy przepłucz 500 mikrolitrami buforu RPE.

Przenieś kolumny do suchych probówek zbiorczych i odwiruj jeszcze jedną minutę, aby usunąć pozostały płyn. Na koniec użyj 50 mikrolitrów wody do wymycia RNA. Następnie użyj spektrofotometru o średnicy 216 animetrów, aby zmierzyć stężenie RNA.

Aby przeprowadzić profilowanie ekspresji genów za pomocą cyfrowego kodu kreskowego, należy rozpocząć od rozmrożenia zestawu kodów reporterowych i zestawu kodów przechwytywania na lodzie. Dodaj 130 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego do zestawu kodów reportera. Odwróć, aby wymieszać i odkręcić.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów mieszanki do każdej z 12 probówek reakcyjnych. Następnie dodać 10 mikrogramów całkowitego tkankowego RNA do każdej probówki i wymieszać przez pipetowanie. W zależności od modelu infekcji, wielkości inokulum i użytego szczepu patogenu, procent RNA patogenu w całkowitym RNA waha się od 0 do 2%, dlatego całkowita ilość RNA, którą należy dodać dla każdego z nich, powinna być zoptymalizowana empirycznie.

Teraz dodaj pięć mikrolitrów zestawu kodów przechwytywania do każdej probówki. Wymieszaj, obracając rurki i szybko odwiruj. Następnie inkubuj reakcje w termocyklerze w temperaturze 65 stopni Celsjusza z podgrzewaną pokrywką przez około 18 godzin.

Wyjmij jeden wkład z próbką z 20 stopni Celsjusza i pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej. Wyjmij dwie płytki z odczynnikiem z czterech stopni Celsjusza i wiruj w wirówce stołowej o sile 670 x G przez dwie minuty. Następnie skonfiguruj stację przygotowawczą, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierając opcję wysokiej czułości.

Następnie usuń reakcje z termocyklera i natychmiast załaduj stację przygotowawczą. Po uruchomieniu trzygodzinnego programu o wysokiej czułości wyjmij wkład i użyj przezroczystej taśmy, aby uszczelnić pasy. W razie potrzeby nałóż olej mineralny na spód wkładu.

Następnie załaduj wkład do analizatora cyfrowego. Skonfiguruj analizator cyfrowy, postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku wyświetlanymi na ekranie, wybierając opcję skanowania w wysokiej rozdzielczości. Po uruchomieniu programu skanującego pobierz wyniki lub wybierz opcję otrzymania ich pocztą e-mail i zaimportuj surowe dane do oprogramowania producenta.

Analizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym. Protokół pokazany w tym filmie ma wyjątkową zaletę polegającą na tym, że wykorzystuje zarówno sondę wychwytującą, jak i sondę raportową w celu zwiększenia specyficzności i zmniejszenia szumu z RNA gospodarza. Jak pokazano tutaj, surowe liczby w tle z niezakażonej próbki tkanki były poniżej 10, podczas gdy surowe liczby z dwóch zainfekowanych próbek tkanek były powyżej 10.

Surowe zliczenia z dwóch próbek biologicznych wykazywały bardzo dobrą korelację z wartością R kwadrat wynoszącą 0,945. Platforma zapewnia również wystarczający zakres dynamiki, aby objąć naturalne poziomy ekspresji biologicznej. Za pomocą zestawu sond określającego 248 genów odpowiedzi środowiskowej określono dwie fazy ekspresji genów patogenu.

Wczesna odpowiedź na ekspresję genów obejmuje geny, których poziomy RNA znacznie różnią się między inokulum a próbkami pobranymi 12 godzin po zakażeniu. Odkryto również późną odpowiedź na ekspresję genów, która obejmuje geny, których poziomy RNA znacznie różnią się między próbkami w okresie 12-godzinnym a 48-godzinnym po zakażeniu. Wyniki te wskazują, że ekspresja genu C.albicans jest dynamicznie regulowana podczas inwazyjnego zakażenia ssaka gospodarza.

Ta metoda jest łatwa i szybka. Cała procedura od pobrania tkanki do odciągania danych zajmuje mniej niż 48 godzin. Czas pracy wynosi około czterech godzin dla 12 próbek.

Chociaż metoda ta została opracowana w celu uchwycenia ekspresji genów patogenu in vivo, ta sama metoda może być również wykorzystana do odpowiedzi na ekspresję genów gospodarza. Dzięki temu badacze mogą uzyskać przydatne informacje z obu stron infekcji jednocześnie.