Multipleksowa detekcja bakterii w złożonych próbkach klinicznych i środowiskowych z wykorzystaniem mikrosfer fluorescencyjnych sprzężonych z oligonukleotydami

Witam, nazywam się Tim Duso z Agriculture and AgriFood Canada. W tym filmie zaprezentujemy protokół określania obecności i liczności określonych mikroorganizmów w złożonej próbce klinicznej lub środowiskowej przy użyciu instrumentu Bio-Plex. Protokół ten wykorzystuje fluorescencyjne kule polistyrenowe, które są chemicznie sprzężone ze specyficzną dla gatunku sondą oligonukleotydową.

Z próbki generowany jest amplikon przy użyciu uniwersalnych starterów PCR, który następnie ulega hybrydyzacji z koralikami sprzężonymi z sondą. Przyrząd BioPlex generuje dwa sygnały: jeden służy do identyfikacji koralika, a drugi do ilościowego oznaczenia sygnału hybrydyzacji.

Ogólnym celem procedury jest szybkie i półilościowe określenie profilu interesującej nas mikrobioty. Zastosowaliśmy tę technikę do określenia profili bakteryjnych w wymazach z pochwy i wykorzystania wygenerowanych danych do diagnozowania bakteryjnego zapalenia pochwy – stanu klinicznego charakteryzującego się zmianą mikrobioty, w której organizmy z rodzaju Lactobacillus stają się mniej rozpowszechnione, a w wymazach z pochwy można wykryć inne organizmy, takie jak Gardnerella, vais i apoian vae. Należy jednak pamiętać, że technikę tę można zastosować do każdej innej mikrobioty, dla której pożądane jest szybkie badanie typu multiplex.

Zacznijmy od opisu działania procedury. Profil mikrobiologiczny jest generowany poprzez amplifikację genu białka opiekuńczego 60 ze wszystkich organizmów obecnych w ekstrakcie DNA z wymazu. Jeden z uniwersalnych starterów amplifikacyjnych został zmodyfikowany poprzez dodanie biotyny oraz wprowadzenie zasad z modyfikacją fosforanową.

Na końcu 5', amplikon zostaje przekształcony w pojedynczą nić za pomocą egzonukleazy T7, która degraduje wyłącznie nić antysensowną. Ponieważ nić sensowna jest chroniona przez zmodyfikowany fosforanem starter PCR, sondy oligonukleotydowe komplementarne do pozostałej nici są kowalencyjnie łączone z fluorescencyjnymi kuleczkami polistyrenowymi. Ponieważ każdy unikalny kolor kuleczki zawiera sondę wykrywającą inny organizm, do jednej próbki można użyć do stu różnych kuleczek.

Jednoniciowy produkt PCR z wymazu z pochwy jest hybrydyzowany z mieszaniną kuleczek sprzężonych z sondami dla wszystkich organizmów będących przedmiotem zainteresowania. Dodawany jest fluorescencyjny reporter FICO ethin, który wiąże się z biotynylowanymi sondami poprzez koniugat strep din. Na koniec mieszanina hybrydyzacyjna jest analizowana na urządzeniu Luminex lub Bio-Plex, które bada każdą kuleczkę indywidualnie pod kątem tożsamości i sygnału hybrydyzacji.

Wyniki tej analizy wskazują na obecność konkretnych mikroorganizmów, a intensywność sygnału hybrydyzacji koreluje z liczebnością danego organizmu. W próbce obecność organizmów związanych z BV może być wykorzystana do diagnostyki bv. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak barwienie Grama, jest generowanie informacji o obecności konkretnych mikroorganizmów oraz ich liczebności.

Procedurę zaprezentuje Jennifer Town, asystentka badawcza w naszym laboratorium. Resuspenduj mikrosfery, wirując je na vortexie przez około 20 sekund. Przenieś 400 µL mikrosfer do probówki typu Eppendorf i wiruj przy 14 000 ×g przez jedną minutę, a następnie usuń i odrzuć nadsącz. Resuspenduj mikrosfery w 50 µL 0,1 M MES pH 4,5.

Dodaj jedną nmol oligonukleotydu wychwytującego do mikrosfer i wymieszaj za pomocą wortexa. Dodaj 2,5 µL świeżego roztworu EDC do mikrosfer. Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.

Wylej roztwór EDC przygotowany wcześniej i przygotuj świeżą próbkę EDC w wodzie o stężeniu 10 mg/mL. Podobnie jak wyżej, dodaj kolejne 2,5 µL świeżego roztworu EDC do mikrosfer i mieszaj w wstrząsarce typu vortex przez pięć sekund. Inkubuj ponownie w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.

Wypłucz kuleczki, dodając 1 ml 0,02% Tween 20, wymieszaj w wortexie, aby resuspendować kuleczki, a następnie odwiruj przy 14 000 ×g przez jedną minutę; usuń i odrzuć nadsącz. Ponownie wypłucz kuleczki, dodając 1 ml 0,1% SDS. Resuspenduj kuleczki w 100 µl buforu TE.

Należy policzyć koraliki w cytometrze krwi w celu określenia stężenia zapasu. Przygotować master mix mikrosfer, rozcieńczając każdy rodzaj koralików do stężenia końcowego 100 koralików na µL w buforze TE. Połączyć koraliki zgodnie z pożądaną liczbą parametrów (plex) analizy. Przechowywać master mix mikrosfer w temperaturze 4°C w ciemności. Mieszanina ta może być przechowywana przez wiele miesięcy w tych warunkach. Następnie należy wygenerować produkt PCR dla każdej próbki.

Bezpośrednio po zakończeniu PCR dodaj zestaw starterów pięcioprymowych modyfikowanych fosforanem i biotyną. Do każdej probówki PCR dodaj 2 µL egzonukleazy T7 i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Po zakończeniu inkubacji dodaj 12,5 µL 0,5 M EDTA pH 8,0 do mieszaniny.

Daje to łącznie około 64,5 µL jednoniciowego produktu PCR. Resuspender mieszankę reakcyjną Resus Bend Microsphere za pomocą pipety. Odmierzyć odpowiednią ilość do probówki typu Eppendorf.

Zakręć probówkę i poddaj ją sonikacji w kąpieli wodnej sonikatora przez dwie minuty. Odmierz 17 µL jednoniciowego produktu PCR do odpowiednich dołków niskoprofilowej płytki 96-dołkowej, a następnie dodaj do każdego z nich 33 µL zawiesiny sonikowanych kulek.

Następnie przykrywamy płytkę pokrywą silikonową i opukujemy ją. Ostrożnie wkładamy płytkę do termocyklera z zaprogramowanymi warunkami: 95 °C przez pięć minut, 60 °C przez 10 minut, a następnie utrzymanie temperatury 60 °C lub pauza w 60 °C przez pięć minut. Koniec, uruchamiamy program.

Przygotuj świeży roztwór strep Aden FICO Ethin. Będziesz potrzebować 25 µL na każdą studzienkę. Przygotuj strep i FICO ethin poprzez rozcieńczenie stoku do stężenia 1 mg/mL.

Od 50 do 20 mikrogramów na mililitr w jednokrotnym buforze tmac. Gdy termocykler dotrze do etapu podtrzymania w temperaturze 60 stopni, należy otworzyć pokrywę, zdjąć silikonową osłonę i dodać roztwór strep din FICO ethin bezpośrednio do każdej studzienki. Następnie należy założyć silikonową osłonę, zamknąć pokrywę termocyklera i wznowić program.

Po zakończeniu programu wyjmij płytkę i szybko przenieś ją do urządzenia Bio-Plex w celu odczytu. Odczyt płytki należy przeprowadzić w ciągu 10 minut. Płytkę należy odczytać w temperaturze 60 °C.

Upewnij się, że Bio-Plex został wstępnie podgrzany do tej temperatury. Tutaj przedstawiono wyniki odpowiadających im barwień metodą Grama oraz profile Luminex próbek podłużnych pobranych od jednej osoby w czasie zero. Barwienie metodą Grama jest zgodne z kliniczną diagnozą BV, co potwierdza test Fiveplex Luminex, wykazujący pozytywne sygnały hybrydyzacji dla organizmów związanych z BV, w tym *Gardnerella vaginalis*, *Atopobium vaginae* oraz *Prevotella ble Faraday*.

Lactobacillus iners jest również wykrywany w niskich stężeniach w miarę upływu czasu. U tej osoby następuje przejście z mikrobioty BV do mikrobioty prawidłowej, co wykazano w barwieniach metodą Grama. Analiza Luminex tych samych próbek pokazuje, że liczebność Gardnerella vaginalis osiąga szczyt, a następnie spada, podczas gdy liczba lactobacillus iners rośnie, aż do momentu, gdy w ostatnim punkcie czasowym staje się ona organizmem dominującym.

Wykorzystanie tej metody do profilowania mikrobioty pozwala na uzyskanie informacji o obecności konkretnych organizmów, a także o ich liczebności. Ponieważ metoda ta opiera się na sekwencjonowaniu, projektowanie sond może być poprzedzone analizą głębokiego sekwencjonowania, a mikroorganizmy zidentyfikowane za pomocą metod sekwencjonowania następnej generacji mogą być śledzone w próbkach w sposób szybki i stosunkowo niedrogi. Obejrzenie tego filmu powinno zapewnić dobre zrozumienie procesu generowania profilu mikrobiologicznego z próbki przy użyciu instrumentu Luminex lub Bio Plex.

Przedstawiliśmy sposób sprzęgania sond oligonukleotydowych z fluorescencyjnymi kuleczkami, otrzymywania jednoniciowego alikonu z próbki klinicznej lub środowiskowej, przeprowadzania hybrydyzacji oraz analizy wyników na urządzeniu Luminex lub Bio Plex. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.