Bioprinting Cellularized Constructs przy użyciu specyficznego tkankowo biotuszu hydrożelowego

Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie wszechstronnego podejścia do projektowania biotuszów hydrożelowych, które mogą być wytłaczane za pomocą urządzeń do biodruku. Biotusze można następnie wykorzystać do wytworzenia trójwymiarowych konstruktów tkankowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biodruku, takie jak to, jak kontrolować właściwości mechaniczne potrzebne do uzyskania materiału, który można wytłaczać za pomocą biodrukarki.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystujemy dostępne na rynku komponenty połączone w sposób modułowy, aby stworzyć prosty i skuteczny biodrukowalny biotusz hydrożelowy. Zastosowania tych technologii obejmują tworzenie organoidów tkankowych 3D, które można wykorzystać do dokładnego modelowania działania leków, toksyn i chorób. Chociaż ta metoda może stanowić ramy do biodruku 3D konstruktów wątroby, może być również stosowana do innych typów tkanek, takich jak mięśnie, płuca i okrężnica.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ istnieje wiele różnych odczynników używanych do tworzenia biotuszu hydrożelowego, ale w rzeczywistości jest to dość proste. Procedurę zademonstruje Young-Joon Seol, post-doc w naszym zespole. Na początek należy przygotować specyficzny tkankowo układ trawienia macierzy zewnątrzkomórkowej, który ma być stosowany w preparacie hydrożelowym, jak opisano w innym miejscu.

Następnie rozpuść fotoinicjator w wodzie w stosunku wagowym do objętościowym 0,1%Aby utworzyć biotusze hydrożelowe, najpierw rozpuść składniki materiału bazowego z zestawów hydrożelowych kwasu hialuronowego w indywidualnych podwielokrotnościach roztworu fotoinicjatora wodnego. Następnie połącz roztwór ECM, 2% tiolowany kwas hialuronowy, 2% tiolowaną żelatynę, środki sieciujące i pożywki do hodowli hepatocytów w pokazanych tutaj proporcjach. Aby poprawić właściwości ekstruzyjne biotuszu, dodaj do mieszaniny 1,5 miligrama na mililitr niemodyfikowanego kwasu hialuronowego i 30 miligramów na mililitr żelatyny.

Następnie wiruj powstałą mieszaninę na wysokich obrotach przez dziesięć sekund przed użyciem. Przed przetestowaniem biotuszu w urządzeniu do biodruku, najpierw przetestuj charakterystykę wytłaczania na stole laboratoryjnym. Za pomocą standardowej strzykawki upuść próbkę biotuszu, a następnie przymocuj do strzykawki igłę o rozmiarze od 20 do 30.

Pozwól, aby biotusz usieciował się, a następnie przepchnij biotusz przez igłę, aby uzyskać gładko wytłaczane włókna hydrożelowe. Jeśli preparat jest w stanie wytworzyć filament z niewielką liczbą guzków lub bez nich, oznacza to, że jest gotowy do biodruku. Aby załadować preparaty biotuszu do biodrukarki, należy pipetować biotusze do wysterylizowanych wkładów do drukarek.

Pozostaw je na 30 minut przed wytłaczaniem, ponieważ biotusz przejdzie spontaniczny etap sieciowania w pierwszym etapie we wkładzie kartridżowym. Następnie załaduj kasetę do zestawu drukowania i podłącz do niej pneumatyczne źródło ciśnienia. Przygotuj prosty wzór, taki jak ta siatka równoległych linii o wymiarach siedem na siedem milimetrów, do wydrukowania, aby ocenić jego kompatybilność z ekstruzją.

Podczas gdy głowica drukująca porusza się w płaszczyźnie XY z prędkością około 300 milimetrów na minutę, należy przyłożyć do wkładu nacisk 20 kilopaskali w celu wytłoczenia biotuszu. Jeśli wytłaczane materiały są grudkowate lub nieregularne, zmniejsz ilość dodawanego środka sieciującego, aby zmiękczyć materiał usieciowany pierwszego etapu. Odpowiednio przygotowana formulacja biotuszu powinna ulegać płynnemu wytłaczaniu, co pozwala na precyzyjne osadzanie i architekturę.

Przygotuj sferoidy wątroby komórek pierwotnych 3D w 96-dołkowej płytce przy użyciu metody wiszącej kropli, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Po trzech dniach w hodowli zbierz sferoidy wątroby z wiszącej płytki kroplowej za pomocą pipety i przenieś je do sterylnej, stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Pozwól sferoidom osiąść na dnie stożkowej rurki przez jedną do dwóch minut.

Następnie ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety. Przenieś od 110 do 125 procent pożądanej objętości wydrukowanej konstrukcji 3D świeżo przygotowanego roztworu hydrożelowego biotuszu do stożkowej probówki zawierającej sferoidy. Następnie ostrożnie pipetuj sferoidy w górę iw dół, aby ponownie zawiesić je w hydrożelowym roztworze biotuszu.

Po równomiernym zawieszeniu przenieś roztwór sferoidalny do wkładu do biodrukarki za pomocą pipety i pozwól roztworowi przejść pierwszy etap sieciowania przez 30 minut. Po etapie sieciowania użyj urządzenia do biodrukowania, aby stworzyć pożądane struktury hydrożelowe zawierające pierwotne sferoidy wątroby. Po każdej warstwie osadzania należy wystawić wydrukowany biotusz na działanie światła UV przez dwie do czterech sekund, aby zainicjować wtórny mechanizm sieciowania.

To ustabilizuje konstrukcje i zwiększy sztywność do pożądanego poziomu. Stężenie alkinu PEG w roztworze kontroluje ogólną gęstość usieciowania, a zatem przede wszystkim kontroluje sztywność końcowej konstrukcji. Po bioprintingu zaobserwowano wysoką żywotność komórek w konstruktach wątroby za pomocą mikroskopii konfokalnej.

W optymalnych warunkach środowiskowych żywotność powinna wynosić powyżej 85%Dodatkowo, gdy konstrukty były barwione pod kątem markerów wskazujących na tkankę wątroby, obserwowano dodatnią ekspresję CYP3A4, izoformy cytochromu P450, albuminy wewnątrzkomórkowej, E-kadheryny, białka adhezyjnego nabłonkowo-komórkowego i DPP4, białka o wysokiej ekspresji w wątrobie. Kiedy pożywki hodowlane zostały przetestowane pod kątem poziomów mocznika i albuminy, stwierdzono, że konstrukt wydzielał zarówno mocznik, jak i albuminę na stałych poziomach w ciągu 14 dni. Sugeruje to ponadto, że specyficzne tkankowo biotusze hydrożelowe pomagają w utrzymaniu funkcji komórek wątroby.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około dwie godziny od początku do końca, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Jest to jednak często zależne od konkretnego urządzenia do biodruku, które jest używane. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że zademonstrowane kroki muszą być często dostosowane tak, aby były kompatybilne z innymi typami tkanek lub urządzeniami do biodrukowania.

Po tej procedurze można stworzyć inne preparaty biotuszu hydrożelowego w celu wsparcia biodrukowania innych typów tkanek. Rozwój tych technologii pomógł utorować drogę do stworzenia wieloorganoidowych platform typu body-on-a-chip do badań przesiewowych leków i modelowania chorób. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zacząć projektować materiały, które można wykorzystać do biodrukowania konstruktów tkanek 3D przy użyciu wieloetapowego sieciowania.

Nie zapominaj, że praca ze światłem ultrafioletowym może być niezwykle niebezpieczna dla wzroku, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie okularów ochronnych przed promieniowaniem UV.