Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów
11 sierpnia 2017
Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.
Ogólnym celem tej metodologii biodruku mikroprzepływowego jest wygenerowanie unaczynionego konstruktu tkankowego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biofabrykacji unaczynionych tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona wszechstronna w generowaniu trójwymiarowej naczyniowej o kontrolowanym kształcie do inżynierii unaczynionych tkanek poprzez wtórny proces wysiewu komórek.
Chociaż protokół ten zapewnia wgląd w inżynierię unaczynionych tkanek serca, może być również stosowany do wielu innych typów tkanek, takich jak wątroba, skóra, a nawet nowotwory. Zwykłe osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ konfiguracja biodrukarki może nie być prosta. Aby rozpocząć tę procedurę, skonstruuj dwuwarstwową koncentryczną mikroprzepływową głowicę drukującą, wkładając mniejszą igłę, służącą jako rdzeń, do środka większej igły, służącej jako osłona.
Upewnij się, że igła rdzeniowa wystaje z zewnętrznej powłoki na około jeden milimetr. Następnie włóż igłę o rozmiarze 23 do cylindra centralnej igły w odwrotnym kierunku. Zrób otwór z boku cylindra zewnętrznej igły i włóż metalowe łącznik o odpowiednim rozmiarze.
Uszczelnij klejem epoksydowym. Zamontuj ekstruder na głowicy biodrukarki za pomocą uchwytu z polimetakrylanu metylu lub PMMA. Następnie, w celu wstrzyknięcia biotuszu i roztworu sieciującego przez dwie rurki PVC oddzielnie, podłącz wloty głowicy drukującej do dwukanałowej pompy strzykawkowej.
Wykonaj biotusz za pomocą mieszaniny alginianu, żelu i fotoinicjatora. Rozpuszczony w 25-milimolowym buforze HEPES, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS. Następnie przygotuj roztwór 0,3 molowego chlorku wapnia w buforze HEPES zawierającym 10% FBS, który posłuży jako sieciujący płyn nośny.
Tuż przed biodrukowaniem trypsynizuj ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej lub HUVEC przez pięć do 10 minut. Odwiruj komórki z prędkością 800 obr./min przez pięć minut w 15-mililitrowej probówce. Ponownie zawiesić komórki w biotuszu w stężeniu od pięciu do 10 razy od 10 do sześciu komórek na mililitr, powoli pipetując od pięciu do 10 razy.
Następnie użyj dwukanałowej pompy strzykawkowej, aby rozpocząć wstrzykiwanie biotuszu HUVEC przez jeden, a płynu sieciującego przez drugi kanał z natężeniem przepływu pięciu mikrolitrów na minutę. Pozwól, aby przepływy działały w sposób ciągły przez maksymalnie jedną minutę, aż się ustabilizują. Następnie rozpocznij ruch głowicy drukującej, utrzymując prędkość osadzania biodrukarki na poziomie około czterech milimetrów na sekundę.
To biodrukowanie powinno skutkować szybkim żelowaniem jonowym składnika alginianowego i osadzaniem się rusztowania z mikrofibry. Po wydrukowaniu rusztowania należy usieciować komponent gelMA za pomocą od pięciu do 10 miliwatów na centymetr kwadratowy światła UV przez 20 do 30 sekund, aby uzyskać żelowanie chemiczne. Następnie usuń nadmiar chlorku wapnia z rusztowania, delikatnie spłukując je ciepłym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Hoduj to rusztowanie w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach objętości CO2, przez okres do 16 dni. Zmieniaj podłoże co najmniej co dwa dni. W okresie hodowli monitoruj HUVEC pod mikroskopem, aż przeniosą się na obrzeża mikrowłókien rusztowania i utworzą struktury przypominające światło.
Następnie ostrożnie usunąć całe podłoże z przestrzeni śródwęzłowej rusztowania z siłą kapilarną za pomocą kawałka sterylnej bibuły filtracyjnej. Natychmiast dodaj kroplę zawiesiny wtórnego typu komórek, takich jak kardiomiocyty, na szczycie rusztowania, umożliwiając komórkom infiltrację całej przestrzeni śródmiąższowej. Następnie inkubuj to rusztowanie w inkubatorze przez 30 minut do dwóch godzin, pozwalając komórkom przylegać do poszczególnych mikrowłókien.
Usuń nieprzylegające komórki, delikatnie myjąc rusztowanie PBS. Hoduj to rusztowanie w odpowiednim podłożu, aż utworzy się pożądana unaczyniona tkanka. Opisany tutaj biodruk mikroprzepływowy pozwala na bezpośrednie biodrukowanie rusztowań mikrowłóknistych przy użyciu biotuszów o niskiej lepkości.
Rusztowanie o wymiarach sześć na sześć na sześć na sześć milimetrów kwadratowych < zawierające ponad 30 mikrowłókien, może zostać wydrukowane biologicznie w ciągu 10 minut. Widoki z góry i z boku mikrofotografii rusztowania pokazują doskonałą integralność strukturalną podczas procesu biodruku. Osiągnięto to dzięki natychmiastowemu usieciowaniu jonowemu składnika alginianowego z chlorkiem wapnia.
Po mikroprzepływowym wytłaczaniu biotuszu, sieciowaniu jonowym i fotosieciowaniu, HUVEC utrzymały stosunkowo wysoką żywotność. Komórki namnażały się i migrowały z początkowo losowego rozkładu w dniu zero do peryferii mikrowłókien w dniu 16. Kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów, które zostały wysiane na rusztowaniu, dojrzały i zasiedliły rusztowanie.
Wykazali silną ekspresję funkcjonalnych biomarkerów serca. Takich jak sarkomeryczna alfa aktynina i koneksyna 43. Mikroskopia konfokalna biodrukowanego rusztowania mikrofibrowego, wypełnionego kardiomiocytami, ujawniła współistnienie zarówno HUVEC, jak i kardiomiocytów.
HUVEC są obecne głównie w granicach mikrowłókien, podczas gdy kardiomiocyty otaczają zewnętrzną część mikrowłókien. Komórki były w stanie utrzymać spontaniczne i zsynchronizowane bicie przez okres od dziewięciu do 28 dni. W zależności od źródła komórek i konfiguracji rusztowań.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać unaczynione tkanki przy użyciu techniki biodruku mikroprzepływowego, a także produkcji głowicy drukującej i operacji biodrukarki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ produkcja głowicy drukującej i operacje biodrukarki mogą być trudne dla osób, które wcześniej z niej nie korzystały. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby dwie igły były koncentryczne w głowicy drukującej i pozwoliły, aby przepływ ustabilizował się przed rozpoczęciem biodrukowania.
Wraz z rozwojem tej techniki, naukowcy zajmujący się inżynierią tkankową i biofabrykacją mają teraz do dyspozycji kolejne narzędzie umożliwiające generowanie unaczynionych konstruktów tkanek do celów regeneracji in vivo lub do modelowania tkanek in vitro.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodologię mikrofluidycznego biodruku ukierunkowaną na generowanie unaczynionych konstruktów tkankowych. Technika ta rozwiązuje problemy w obszarze biofabrykacji, umożliwiając stworzenie trójwymiarowego łoża naczyniowego, które może zostać zasiedlone przez wtórne typy komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofabrykacja
- Mikroprzepływy
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Projektowanie unaczynionych tkanek ma kluczowe znaczenie dla rozwoju organoidów.
- Obecne metody napotykają ograniczenia w tworzeniu złożonych struktur tkankowych.
- Mikrofluidyczny biodruk oferuje wszechstronne podejście pozwalające przezwyciężyć te wyzwania.
- Technikę tę można dostosować do różnych typów tkanek, w tym tkanek serca, wątroby i skóry.
Cel badania
- Opracowanie protokołu tworzenia unaczynionych konstruktów tkankowych.
- Pogłębienie wiedzy na temat technik biofabrykacji.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych zastosowań w inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Konstrukcja dwuwarstwowej koncentrycznej głowicy do druku mikrofluidycznego.
- Wykorzystanie mniejszej tępej igły jako rdzenia wewnątrz większej tępej igły.
- Wsiewanie wtórnych typów komórek do struktury mikrowłóknistej.
- Zastosowanie metody w odniesieniu do różnych typów tkanek poza tkankami serca.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczne wytworzenie unaczynionego konstruktu tkankowego.
- Wykazano wszechstronność w tworzeniu różnych typów tkanek.
- Przedstawiono spostrzeżenia dotyczące inżynierii złożonych struktur tkankowych.
- Zidentyfikowano potencjalne wyzwania dla osób rozpoczynających pracę z procesem biodruku.
Wnioski
- Metoda mikrofluidycznego biodrukowania jest skuteczna w inżynierii unaczynionych tkanek.
- Podejście to może wspomóc postępy w badaniach nad organoidami.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowania na inne typy tkanek i warunki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrofluidyczny biodruk umożliwia projektowanie unaczynionych konstruktów tkankowych o wysokiej wierności strukturalnej, co rozwiązuje krytyczny problem w rozwoju modeli przedklinicznych. Poprzez generowanie przepływowych sieci mikrovascularnych wewnątrz rusztowań hydrożelowych, metoda ta wspiera tworzenie modeli tkankowych o większym znaczeniu fizjologicznym do badań przesiewowych leków oraz analiz mechanistycznych. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną we wczesnych fazach odkrywania, zapewniając regulowaną platformę do badania interakcji międzykomórkowych, dojrzewania tkanek oraz odpowiedzi funkcjonalnych w kontrolowanych warunkach.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań między komórkami śródbłonka a perycytami lub komórkami zrębu w obrębie zdefiniowanej niszy naczyniowej w celu walidacji celów terapeutycznych zaangażowanych w angiogenezę lub przepuszczalność naczyniową.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny, kontrolowany mikrofluidycznie system do generowania unaczynionych rusztowań o spójnej architekturze mikrowłókien i formowaniu światła naczyń.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę wpływu związków na integralność naczyniową i migrację komórek w trójwymiarowym mikrośrodowisku odpowiadającym warunkom ludzkim.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych rusztowań z mikrowłókien z enkapsulowanymi komórkami śródbłonka, które tworzą struktury przypominające światło naczynia, co umożliwia ilościową ocenę formowania się sieci naczyniowej w czasie.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z biodrukarką z dwukanałową pompą strzykawkową pozwala na precyzyjną kontrolę dozowania bioatramentu i cieczy sieciującej, co umożliwia wysokoprzepustowe wytwarzanie rusztowań.
- Gotowość do analizy: Umożliwia wytworzenie rusztowań zawierających >30 mikrowłókien w objętości 6x6x6 mm w ciągu 10 minut, co pozwala na skalowalną preparatykę pod kątem późniejszego siewania komórek wtórnych oraz przesiewu związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia wtórne wysiewanie kardiomiocytów lub innych komórek parenchymatycznych do przestrzeni śródmiąższowej, co ułatwia badanie dojrzewania unaczynionej tkanki oraz zsynchronizowanej funkcji skurczowej.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera długoterminową hodowlę (>16 dni) z monitorowaniem migracji komórek, formowania światła naczyniowego oraz ekspresji biomarkerów (np. sarkomerycznej alfa aktyniny, konneksyny 43) w celu modelowania odpowiedzi na poziomie tkankowym.
- Minimalizacja ryzyka: Pozwala na ocenę żywotności, proliferacji i funkcjonalnego dojrzewania komórek w warunkach przypominających perfuzję, co redukuje straty wynikające ze słabego przyjmowania się naczyń w późniejszych etapach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego – zapewniając unaczynioną platformę, która stanowi pomost pomiędzy prostymi monokulturami a złożonymi modelami in vivo.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków zależnych od naczyń poprzez umożliwienie kontrolowanej kokultury komórek śródbłonka i komórek miąższowych w określonej geometrii 3D.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy rusztowania o powtarzalnej mikrostrukturze i endotelializacji, odpowiednie do oceny wpływu związków na stabilność naczyniową i organizację tkanki.
- Analityka: Umożliwia ilościowe odczyty za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu oceny rozkładu komórek, tworzenia światła naczyniowego oraz kolokalizacji biomarkerów, co pozwala ocenić jakość tkanki i dojrzałość funkcjonalną.
- Badania translacyjne: Modeluje rozwój unaczynionej tkanki – od wczesnego tworzenia sieci śródbłonka po integrację wtórnych typów komórek, wspierając przedkliniczną walidację kandydatów na leki celowane naczyniowo lub regeneracyjne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Projekt mikrofluidycznej głowicy drukującej oraz system biotuszu (GelMA-alginian z sieciowaniem jonowym/fotochemicznym) stanowią platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do wielu typów tkanek (serca, wątroby, skóry) oraz wtórnych typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez generowanie unaczynionych tkanek z przepuszczalnymi strukturami przypominającymi światło naczynia oraz utrzymaną funkcjonalnością komórkową (np. synchronizowane skurcze do 28 dni).
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację wytwarzania rusztowań dzięki mikrofluidycznej kontroli przepływu, co redukuje zmienność średnicy mikrowłókien, efektywności sieciowania i rozkładu komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych informacji na temat kompatybilności naczyniowej i odpowiedzi na poziomie tkankowym, ograniczając ryzyko niepowodzeń w późniejszych etapach z powodu niewystarczającego unaczynienia.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich efekty w modelu unaczynionej tkanki odpowiedniej dla człowieka, która odwzorowuje kluczowe cechy strukturalne i funkcjonalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w wytwarzaniu urządzeń mikroprzepływowych, w tym w montażu koncentrycznych igieł oraz uszczelnianiu żywicą epoksydową w celu zapobiegania wyciekom.
- Zależne od systemów dwukanałowych pomp strzykawkowych oraz sprzętu do fotousieciowania UV w celu precyzyjnego dozowania bioatramentu i stabilizacji GelMA.
- Wymaga optymalizacji stężenia komórek (5–10×10⁶ HUVECs/mL) oraz szybkości przepływu (5 µL/min), aby zapewnić żywotność komórek i jednorodną enkapsulację podczas drukowania.
- Wymaga pracy w warunkach aseptycznych oraz zastosowania sterylnego papieru filtracyjnego do usuwania medium podczas wtórnego wysiewu komórek, aby uniknąć kontaminacji i zapewnić prawidłową infiltrację.
- Ograniczone koniecznością płukania po drukowaniu w celu usunięcia nadmiaru chlorku wapnia, co stanowi dodatkowy etap manualny, który musi być standaryzowany pomiędzy partiami.
