Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykazanie ogólnej przydatności analizatora FRET w optymalnych warunkach poprzez ilościowe oznaczenie zawartości cukru w dostępnych w handlu napojach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie detekcji i monitorowania małych cząsteczek, takich jak cukier. Główną zaletą tej techniki jest możliwość efektywnego monitorowania świeżego sygnału odpowiedzi na małe cząsteczki bez konieczności stosowania drogich, zaawansowanych fluorometrów.

Procedurę zademonstruje dr Han z naszego laboratorium. Najpierw należy przygotować plazmid cyjanowego i żółtego fluorescencyjnego biosensora specyficznego dla maltozy lub sacharozy. Następnie 5 mL pożywki Luria broth należy zaszczepić pojedynczą kolonią E.Coli DE3 i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przez 16 godzin.

Następnie przenieś 1 mL hodowli do kolby zawierającej 100 mL LB. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsającym, aż gęstość optyczna przy 600 nm wyniesie około 0,5. Odwiruj hodowlę w wirówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Szybko resuspenduj osad w 50 mL lodowatej wody destylowanej i ponownie wiruj przez 20 minut.

Resuspenduj osad w 50 µL roztworu glicerolu w stężeniu 10% objętościowo w lodowatej wodzie destylowanej. Delikatnie mieszaj zawiesinę aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 100. W lodowatej kuwecie do elektroporacji połącz mieszaninę z 10 ng plazmidu CMY.

Przeprowadź elektroporację mieszaniny. W kuwecie resuspenduj komórki w 1 ml pożywki SOC, a następnie przenieś je do probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml. Pozostaw komórki do regeneracji, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Wysiać komórki na płytkę z agarem LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Za pomocą pętli przenieść pojedynczą kolonię do 10 mL LB zawierającego 100 µg/mL ampicyliny.

Mieszaninę inkubować w temperaturze 37°C przy jednoczesnym wytrząsaniu przez 12 godzin w celu przygotowania kultury startowej. Przenieść 5 mL kultury startowej do 500 mL pożywki LB z ampicyliną i inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze wytrząsającym. Po osiągnięciu gęstości optycznej przy 600 nm wartości 0,5, dodać IPTG do uzyskania stężenia końcowego 0,5 mM.

Po inkubacji hodowli przez 24 godziny, odwiruj komórki w wirówce przez 20 minut. Ostrożnie usuń nadsącz i resuspenduj osad w pięciu mililitrach buforu wiążącego. Poddaj komórki sonikacji na lodzie przez 10 sekund, a następnie schłodź je przez 10 sekund.

Powtórz proces sonikacji i chłodzenia jeszcze pięć razy. Wirowarkuj lizat przez 30 minut. Przenieś nadsącz do drugiej probówki zbiorczej.

Oczyść supernatant na kolumnie powinowactwa niklowego NTA. Napełnij koncentrator 10 000 milliwatt 20 mililitrami oczyszczonej próbki. Odwiruj próbkę przez 10 minut, a następnie ponownie napełnij koncentrator 0,8% roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym.

Powtarzaj ten proces z pozostałą częścią próbki w ten sposób, po 20 mililitrów naraz, aż całe białko zostanie skoncentrowane i odsolone. Przechowuj oczyszczony biosensor FRET w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przygotuj 0,2 mikromolarny roztwór białka biosensora CMY w 0,8% PBS jako roztwór detekcyjny.

Włącz przenośny analizator FRET. Ustaw temperaturę analizy na 53 °C. Następnie przełącz urządzenie w tryb kalibracji.

Napełnij kuwetę 0,8% PBS w celu wyznaczenia tła. Podgrzej próbkę do 53 °C w analizatorze, a następnie ustaw tło. Następnie napełnij kuwetę roztworem detekcyjnym.

Umieść kuwetę w analizatorze i ustaw linię bazową. Wymień kuwetę na taką zawierającą roztwór detekcyjny i jeden milimol cukru. Ustaw intensywność przy nasyceniu, aby zakończyć kalibrację.

Aby rozpocząć przygotowanie próbki napoju do analizy zawartości cukru, należy odwirować 1 ml napoju w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Usunąć nadsącz za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,2 µm. Połączyć 0,1 ml filtratu i 0,9 ml 0,8% PBS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.

Delikatnie wymieszaj mieszaninę w wirówce typu vortex, aby zapewnić całkowite rozcieńczenie. Przenieś 5 µL rozcieńczonej próbki napoju oraz 495 µL roztworu detekcyjnego do kuwety. Umieść kuwetę w analizatorze i podgrzej próbkę do 53 °C.

Naciśnij przycisk set, aby zmierzyć zawartość cukru w próbce. W tej metodzie wydajność FRET jest mierzona jako stosunek intensywności emisji żółtego białka fluorescencyjnego do cyjanowego białka fluorescencyjnego w biosensorze. Optymalna temperatura pomiaru dla tych biosensorów CMY wynosi od 50 do 55 °C, ponieważ różnica w stosunku intensywności emisji między roztworem kontrolnym a nasyconym roztworem maltozy jest wtedy największa.

Biosensor CMY-BII został wykorzystany do oceny zawartości maltozy w trzech napojach w temperaturze 53 stopni. Krzywa zależności odpowiedzi od dawki jest generowana poprzez wyznaczenie tego stosunku dla różnych stężeń maltozy w danej temperaturze. Stosunek emisji jest powiązany ze stężeniem maltozy przy użyciu wartości uzyskanych podczas kalibracji.

Zmierzone zawartości maltozy przedstawiono wraz z całkowitą zawartością cukrów podaną przez producentów napojów. Napój A zawierał źródła maltozy, takie jak ryż i jęczmień. Odpowiednio, zaobserwowana ilość maltozy stanowi około połowy całkowitej zgłoszonej zawartości cukru.

Napój C, napój sportowy, charakteryzował się bardzo niską zawartością maltozy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy urządzenia i czujników FRET w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat ilościowego oznaczania tak małych cząsteczek za pomocą niestandardowego, przenośnego analizatora FRET.