Ekstrakcja kapsułek roślinnych do zastosowań w mikrokapsułkowaniu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie usprawnionego procesu ekstrakcji kapsułek egzysty sporopoleninowych (SEC) do zastosowań w mikroenkapsulacji. Metoda ta pozwala na szybkie uzyskanie czystych mikrokapsułek do zastosowań w przemyśle spożywczym i opiece zdrowotnej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość znacznego skrócenia czasu procesu ekstrakcji SEC w celu otrzymania czystych i nienaruszonych kapsułek.

Choć metoda ta może dostarczyć informacji na temat usprawnionego procesu ekstrakcji SEC oraz szczegółowej charakterystyki etapowej, może być również wykorzystana do przeprowadzenia podstawowych ocen mikrostrukturalnych i morfologicznych różnych biomateriałów pochodzenia roślinnego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na konwencjonalny, trwający od 8 do 10 dni proces ekstrakcji, który wymaga użycia silnie korozyjnych kwasów w podwyższonych temperaturach. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować układ do refluksu w dygestorium, wyposażony w chłodnicę szklaną, system cyrkulacji wody oraz łaźnię wodną.

Ponieważ proces ekstrakcji SEC wiąże się z użyciem silnie żrących kwasów i rozpuszczalnika organicznego, należy go przeprowadzać przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak gogle, fartuch laboratoryjny, maseczka ochronna i rękawice zgodnie z ostrzeżeniami o zagrożeniach. Należy ostrożnie odważyć 100 g zarodników L clavatum, unikając pylenia i zachowując odległość od wszelkich źródeł zapłonu. Następnie zarodniki należy powoli przenieść do jednolitrowej kolby okrągłodennej z PTFE z magnesem do mieszania.

Do zarodników należy dodać 500 ml acetonu i delikatnie potrząsnąć kolbą, aby utworzyć jednorodną zawiesinę. Następnie kolbę należy umieścić w łaźni wodnej ustawionej na 50 °C i połączyć z chłodnicą zwrotną. Zawiesinę należy ogrzewać w stanie wrzenia z refluksem przez sześć godzin, mieszając przy 200 RPM.

Po ochłodzeniu zawiesiny w temperaturze pokojowej, przefiltruj ją za pomocą papieru filtracyjnego pod próżnią i zbierz odtłuszczone zarodniki do dużych szklanych szalek Petriego. Osusz zarodniki w temperaturze pokojowej, przykrywając szalki Petriego folią aluminiową z otworami umożliwiającymi odparowanie rozpuszczalnika. Po przeniesieniu wysuszonych, odtłuszczonych zarodników do jednolitrowej kolby PTFE, dodaj 500 ml 85% roztworu kwasu fosforowego.

Kolbę umieść w łaźni wodnej ustawionej na 70 °C i podłącz ją do chłodnicy zwrotnej. Zawiesinę ogrzewaj w warunkach refluksu przez 30 godzin przy ciągłym mieszaniu. Po ochłodzeniu zawiesiny do temperatury pokojowej rozcieńcz ją 500 ml ciepłej wody dejonizowanej, a następnie odseparuj SECs poprzez filtrację próżniową przy użyciu papieru filtracyjnego.

Następnie przenieś SEC do trzy litrowego zlewki szklanej, aby przeprowadzić serię płukań. W dygestorium dodaj do SEC 800 ml gorącej wody dejonizowanej i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Następnie przefiltruj zawiesinę za pomocą papieru filtracyjnego pod próżnią.

Przenieś SEC do czystego trzy litrowego zlewki szklanej. Po powtórzeniu poprzednich kroków pięć razy dodaj do SEC 600 mililitrów gorącego acetonu i delikatnie mieszaj przez 10 minut. Zbierz SEC poprzez filtrację próżniową i przenieś je do czystej trzy litrowej zlewki szklanej.

Po powtórzeniu poprzednich kroków z zastosowaniem odpowiednich rozpuszczalników, przenieś czyste SEC do sześciu dużych szklanych szalek Petriego i susz w dygestorium w temperaturze pokojowej przez 24 h, aby usunąć całą wodę. Następnie susz SEC w piecu próżniowym w temperaturze 60 °C i pod próżnią wynoszącą 1 mbar przez 10 h lub do osiągnięcia stałej masy. Następnie przenieś wysuszone SEC do butelki z polipropylenu w celu przechowywania w szafce osuszającej.

Przygotować 1,2 mililitra roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w wodzie dejonizowanej i przenieść go do 50 mililitrowej probówki polipropylenowej. Do roztworu BSA dodać 150 miligramów SECs. Mieszaninę wortexować przez 10 minut, aż do uzyskania homogenicznego roztworu.

Po przykryciu probówki papierem filtracyjnym należy przenieść ją do kolby liofilizatora i suszyć przez cztery godziny w próżni przy ciśnieniu jeden millibar. Po wysuszeniu SECs obciążonych BSA należy usunąć aglomeraty za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie przenieść SECs obciążone BSA do probówki o pojemności 50 mililitrów i dodać dwa mililitry wody dejonizowanej w celu usunięcia pozostałości BSA.

Zebrać SEC za pomocą wirowania przy 4 704 ×g przez pięć minut. Po zakończeniu odlać nadsącz. Powtórzyć płukanie wodą dejonizowaną.

Następnie zakryj probówkę zawierającą SEC obciążone BSA papierem filtrowanym. Potem przenieś SEC do zamrażarki na jedną godzinę. Liofilizuj SEC przez 24 godziny.

Przechowywać SEC w zamrażarce do czasu dalszej charakterystyki. Odważyć 5 mg SEC obciążonych BSA do dwumililitrowej probówki polipropylenowej. Dodać 1,4 ml PBS i mieszać w wstrząsarku wierzchołkowej (vortex) przez pięć minut.

Następnie poddaj zawiesinę sonikacji za pomocą sondy przy amplitudzie 40% przez trzy cykle po dziesięć sekund. Po zakończeniu przefiltruj roztwór, używając filtra z polietersulfonu o wielkości oczek 0,45 micron. Po wykonaniu powyższych kroków z placebo SECs, zmierz absorbancję SECs obciążonych BSA przy 280 nanometers, wykorzystując placebo jako próbę ślepą.

Na koniec należy określić ilość enkapsulowanego BSA, wykorzystując krzywą wzorcową BSA w PBS. Obrazy SEM wskazują na nienaruszone zarodniki o unikalnej mikrostrukturze, a przed procesowaniem w obrazie przekroju poprzecznego zaobserwowano organelle sporoplazmatyczne w skali mikronowej. Po odtłuszczeniu zarodników i obróbce alkalicznej nie zaobserwowano żadnych zmian morfologicznych ani strukturalnych.

Obrazy SEM po acidolizie wykazują nienaruszone SECs pozbawione materiałów sporoplazmatycznych. Analiza CHN nie wykazuje istotnego usunięcia materiału białkowego w odtłuszczonych i traktowanych alkaliami SECs. Większość materiałów białkowych zostaje usunięta podczas acidolizy.

Analiza DIPA wykazuje jednorodny rozkład wielkości SEC po acidolizie trwającej do 30 godzin. Integralność strukturalna SEC maleje przy przedłużonej acidolizie. Dane z SEM i DIPA wskazują, że po etapie odtłuszczania acidoliza doprowadziła do powstania nienaruszonych SEC o jednorodnym rozkładzie wielkości.

Dane z CLSM wskazują, że niepoddane obróbce SEC wykazują autofluorescencję ze względu na składniki sporoplazmy znajdujące się wewnątrz wnęki zarodnika. Po przetworzeniu wyłącznie metodą acidolizy cała zawartość sporoplazmatyczna zostaje usunięta. Po enkapsulacji FITC-BSA wewnątrz SEC obserwuje się zieloną fluorescencję.

Obrazy SEM przedstawiają nienaruszone mikrożebrowania po załadunku BSA. Po załadunku BSA do SEC nie zaobserwowano istotnych zmian w średnicy, kolistości oraz stosunku boków. Ilościowe oznaczenie BSA z enkapsulowanych SEC potwierdza powtarzalność procesu mikroenkapsulacji, przy załadunku 0,170 ± 0,01 g BSA na gram SEC.

Po opanowaniu tej usprawnionej metody, proces ekstrakcji SEC może zostać przeprowadzony w ciągu 48 godzin, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas stosowania tej procedury w odniesieniu do różnych zarodników i pyłków roślinnych, ważne jest pamiętanie o etapowej ocenie analizy strukturalnej, morfologicznej i elementarnej w celu uzyskania nienaruszonych i czystych kapsułek. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne procesy ekstrakcji z wykorzystaniem enzymów alkalicznych, aby sprawdzić wykonalność zoptymalizowanego procesu dla różnorodnych kapsułek pochodzenia roślinnego.

Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie mikroenkapsulacji, dostarczania leków oraz inżynierii tkankowej do badania różnorodnych roślinnych SEC jako biomateriałów nowej generacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekstrahować i charakteryzować SEC z zarodników roślin i ziaren pyłku, a także jak przeprowadzać enkapsulację leków i biomakrocząsteczek w SEC.