Wysokoprzepustowa mikroenkapsulacja pojedynczych komórek i wielu komórek

Zastosowania wykorzystujące komórki zamknięte w niewielkich kroplach o objętości piko-litrów były często ograniczone przez brak możliwości kontrolowania liczby komórek w pojedynczej kropli. Niniejszy protokół przedstawia metodę kontroli enkapsulacji komórek poprzez połączenie dwóch odrębnych zjawisk mikrofluidycznych: hydrodynamicznego uporządkowania komórek oraz generowania kropel w mikro-dyszy z ogniskowaniem przepływu. W kanale dopływowym zapewniono odpowiednio wysoką szybkość przepływu roztworu wodnego z zawies진ymi komórkami lub cząstkami, co prowadzi do powstania szeregów o równomiernych odstępach w kierunku przepływu w dół strumienia.

Dysza do generowania kropel z ogniskowaniem przepływu jest wykorzystywana do tworzenia kropel wodnych z częstotliwością rzędu kilohertz w dopuszczalnym olejowym płynie nośnym stabilizowanym surfaktantem. Uporządkowane pociągi cząsteczek w komórkach są następnie łączone z generowaniem kropel poprzez dostrojenie szybkości przepływu fazy wodnej i olejowej, aby zapewnić szybkość generowania kropel zsynchronizowaną z docieraniem podłużnie uporządkowanych komórek lub cząsteczek do dyszy generującej krople, przy czym cząsteczki są wykorzystywane jako substytuty komórek. Aby zademonstrować ten protokół, szybkości przepływu muszą być wystarczająco małe, aby ograniczyć płyn.

Naprężenia ścinające działające na komórki biologiczne, nakładanie się procesów generowania kropli z uporządkowaniem komórek oraz żywotność komórek. Ograniczenia dotyczące natężenia przepływu fazy wodnej zapewniają idealny reżim operacyjny dla kontrolowanej enkapsulacji pojedynczych i wielu komórek. Analiza danych z mikroskopii wideo wykazuje, że wydajność enkapsulacji pojedynczych i podwójnych komórek lub cząstek przewyższa wydajność enkapsulacji losowej i znacznie redukuje liczbę kropli, które nie zawierają pożądanej liczby komórek lub cząstek.

Ograniczenie przestrzeni komórek i kropel ogranicza rozcieńczenie wydzielin komórkowych, uwydatnia heterogenność komórek, a także kontroluje sygnały międzykomórkowe w porównaniu z zawiesiną masową. Wydajne metody enkapsulacji tych komórek w kroplach stanowią cenne narzędzie dla badaczy biologii. Aby rozpocząć tę procedurę, zaprojektuj wzór mikrokanału przedstawiony na tej figurze w oprogramowaniu AutoCAD.

Długi odcinek kanału przedstawia kanał porządkujący przepływ fazy wodnej o szerokości 27 mikronów. Powiększony schemat dyszy pokazuje równe szerokości kanałów wynoszące 27 mikronów dla kanału porządkującego fazę wodną oraz kanału olejowego, po których następuje zwężenie dyszy do 22 mikronów i gwałtowne rozszerzenie do szerszego kanału o szerokości 61 mikronów. Wysokość urządzenia wynosi 52 mikrony.

Zarówno wloty wodne, jak i olejowe są wyposażone w duże filtry do zanieczyszczeń z przerwami o wielkości zbliżonej do szerokości kanału porządkującego, co zilustrowano na tym powiększonym schemacie wlotu olejowego. Tutaj przedstawiono rzeczywisty obraz kanału porządkującego oraz dyszy z wstrzykniętym barwnikiem. Należy zlecić zewnętrznemu producentowi wydruk maski przezroczystości o wysokiej rozdzielczości na folii Mylar lub kwarcu, w której kanały są przezroczyste na ciemnym tle.

Następnie przygotuj matrycę z krzemu i fotorezystu SU-8 do odlewania replik. Przymocuj matrycę taśmą do dna szalki Petriego w celu wykonania repliki z PDMS. Po zakończeniu procesu odlewania i wycięciu obrysu urządzenia, użyj wycinaka do biopsji o średnicy zewnętrznej 0,75 mm, aby wykonać porty płynowe w trzech okrągłych obszarach pokazanych na tej figurze. Przyklej taśmę klejącą do strony z wzorem PDMS i odklej ją, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia po wiązaniu plazmowym.

PDMS do czystego szklanego przedmiotu szkiełka. Umieść całe urządzenie w piekarniku i stopniowo podgrzewaj go do 120 °C. Pozostaw urządzenie w piekarniku w temperaturze 120 °C przez noc, aby zakończyć proces wiązania i przywrócić PDMS jego pierwotny stan hydrofobowy.

Alternatywną metodą nadania powierzchni szklanej kanału właściwości hydrofobowych jest wstrzyknięcie powłoki, takiej jak Aquapel, do portów płynowych, a następnie przedmuchanie ich powietrzem. Używając strzykawki o pojemności 1 ml i igły, należy pobrać kilkaset µL powietrza, a następnie niewielką ilość Aquapel, wystarczającą jedynie do wypełnienia metalowej końcówki igły. Należy ostrożnie, lecz zdecydowanie wstrzyknąć Aquapel, a następnie przedmuchać porty płynowe powietrzem. Należy robić to uważnie, aby nie doprowadzić do gwałtownego zerwania wiązania między PDMS a szkłem.

Powtórz przedmuchanie powietrzem wszystkich portów wlotowych i wylotowych, wycierając nadmiar wody, aby uniknąć powstania osadów, które po wyschnięciu mogłyby zapchać kanały. Kontrola stężenia komórek jest niezbędna do uzyskania odpowiedniej liczby komórek w każdej kropli. Proces ten składa się z dwóch trudnych etapów.

Pierwszym aspektem jest wcześniejsze oszacowanie odpowiedniego stężenia, a drugim utrzymanie tego stężenia podczas eksperymentu. W przypadku urządzenia zastosowanego w niniejszym badaniu, komórki lub cząstki o rozmiarze od 8 do 15 µm powinny być odpowiednie do kontrolowanej enkapsulacji. W tej demonstracji jako substytuty komórek zostaną użyte mikrosfery z polistyrenu o rozmiarze 9,9 µm. Aby przygotować stężenie wodnej zawiesiny cząstek pozwalające na osiągnięcie idealnej enkapsulacji, należy rozpocząć od stężenia roztworu podstawowego mikrosfer wynoszącego 1% ciał stałych wagowo, opierając się na poprzednich danych dotyczących pełnego uporządkowania. W ramach wskazówek, zwiększ stężenie do 1,5% ciał stałych poprzez delikatne odwirowanie 1 mL próbki podstawowej, usunięcie 250 µL nad supernatu i ponowne zawieszenie cząstek za pomocą mieszania w wortexie lub łagodniejszego mieszania.

W przypadku użycia komórek, zarówno komórki, jak i cząsteczki polistyrenu mają gęstość większą niż jeden, choć nie pokazano tego w tym filmie. W przypadku długotrwałych eksperymentów trwających od wielu minut do wielu godzin, można wyrównać wyporność roztworu poprzez dodanie substancji rozpuszczonej, takiej jak chlorek wapnia dla cząsteczek lub opti prep dla komórek. Po przygotowaniu zawiesiny komórek lub cząsteczek, należy przygotować 10 mililitrów próbki ciągłej fazy olejowej fluorowęglowej w 15 mililitrowej probówce do wirowania i wymieszać ją w wstrząsarzu typu vortex.

Wymieszaj surfaktant i olej fluorowęglowy w stosunku około 2,5% wagowo. W tym przypadku otrzymaliśmy mieszaninę o stężeniu 2,4% wagowo, co jest wartością dopuszczalną do przeprowadzenia eksperymentu z mikroenkapsulacją. Najpierw włącz zasilanie odwróconego mikroskopu optycznego oraz kamery wysokich prędkości.

Skup się na warstwie mikrokanałów i sprawdź, czy kanały nie są zapchane lub czy nie znajdują się w nich zanieczyszczenia, które mogłyby zostać oderwane. Wybierz kanał wolny od dużych zanieczyszczeń lub wyraźnych zatorów. Odetnij trzy odcinki półprzezroczystej rurki PVC typu tigon dla wlotu fazy wodnej, wlotu oleju i wylotu emulsji, aby zminimalizować objętość martwą.

Odetnij odpowiednią długość rurki, aby sięgała od pomp strzykawkowych do mikroskopu. Końce odciętych rurek przytnij pod kątem 45 stopni. Aby ułatwić wprowadzenie do portów płynowych, użyj pęsety, aby wcisnąć końce rurek w porty. Następnie wciśnij stalową igłę strzykawkową z tępym końcem o rozmiarze 30 gauge w wolny koniec rurki wlotowej dla roztworu wodnego.

Powtórz tę procedurę dla rurki wlotowej oleju. Przenieś urządzenie i przymocuj rurki do stolika mikroskopu, używając obiektywu 20x, a następnie ustaw i ustaw ostrość na dyszy urządzenia. Ręcznie wyreguluj mikroskop zgodnie z zasadą oświetlenia Köhlera, aby zapewnić optymalne doświetlenie w płaszczyźnie ogniskowania.

Używając oprogramowania kamery wysokich prędkości, przytnij pole widzenia wokół dyszy, aby umożliwić zastosowanie wyższych częstotliwości klatek, a następnie ustaw częstotliwość klatek, czas ekspozycji oraz inne ustawienia kamery zgodnie z wymaganiami dla optymalnego nagrywania. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml wcześniej przygotowanym, dobrze wymieszanym roztworem fazy wodnej. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml roztworem fazy olejowej.

Przechyl jedną z napełnionych strzykawek pionowo i stuknij w nią, aby przesunąć pęcherzyki powietrza do otworu wylotowego strzykawki. Trzymając strzykawkę pionowo, powoli naciskaj tłok przez czas wystarczający do wypchnięcia powietrza do czubka strzykawki. Połącz strzykawkę z odpowiednią igłą już przymocowaną do urządzenia.

Naciśnij tłok, aby przepchnąć powietrze przez przestrzeń martwą igły strzykawki, aż ciecz zostanie wypchnięta przez cewkę niemal do urządzenia; bezpiecznie zamocuj strzykawkę do pompy strzykawkowej i zablokuj tłok. Powtórz połączenia dla drugiej strzykawki i zamocuj ją do drugiej pompy strzykawkowej, następnie włącz każdą z pomp i zaprogramuj je. Zgodnie z protokołami producenta, ustaw początkowe prędkości przepływu na 50 µL/min dla fazy olejowej oraz 5 µL/min.

W przypadku rozpoczęcia fazy wodnej pompy czekają, aż każdy płyn wpłynie do urządzenia i wypełni kanały, wypychając pozostałe pęcherzyki powietrza. Przy zastosowaniu początkowych prędkości przepływu może to zająć kilka minut. Obserwuj tworzenie się kropli przy dyszy.

Powoli zwiększaj szybkość przepływu fazy wodnej, aby zaobserwować uporządkowanie cząstek w długim kanale z roztworem wodnym. Podczas zwiększania szybkości przepływu nie doprowadź do momentu, w którym w dyszy zostanie wywołany strumień cieczy wodnej, jak pokazano w tym przykładzie; korzystając z innej dyszy do generowania kropel, zwróć uwagę na niestabilny przepływ i niespójną kroplę. Jeśli stężenie cząstek jest zbyt niskie, aby zapewnić naprzemienne szeregi z niewielką liczbą brakujących cząstek, a próbka nie została dopasowana pod kątem wyporności, fizycznie przechyl pompę strzykawkową w stronę wylotu strzykawki, aby zapewnić stopniowe osiadanie cząstek w kierunku wylotów strzykawki.

Po uzyskaniu odpowiedniego uporządkowania, dostosuj szybkość przepływu oleju, aby nastroić częstotliwość generowania oraz rozmiar kropel. Iteracyjnie reguluj obie szybkości przepływu, aby osiągnąć pożądane stopnie enkapsulacji i objętości kropel. Po potwierdzeniu stabilnej, uporządkowanej enkapsulacji, przenieś rurkę wylotową z zasobnika na odpady do zasobnika zbiorczego w celu późniejszego wykorzystania.

Wysoką wydajnością można osiągnąć enkapsulację pojedynczych i podwójnych cząsteczek lub komórek. Zastosowanie niniejszego protokołu pozwoliło uzyskać reprezentatywny wynik enkapsulacji pojedynczych cząsteczek przy szybkości przepływu fazy olejowej wynoszącej 60 µL/min oraz szybkości przepływu fazy wodnej wynoszącej 9 µL/min. Lambda, czyli średnia liczba cząsteczek na kroplę, wynosi 0,95.

Odstępy między cząsteczkami w kierunku przepływu wynoszą około 17 do 18 mikronów dla w pełni uporządkowanych cząsteczek naprzemiennych. Szybkość generowania kropel w tym przykładzie wynosi 6,1 kilohertz przy średniej wielkości kropli 24,4 picoliters. Histogram porównuje wydajność enkapsulacji cząsteczek w kroplach dla kolejności enkapsulacji pojedynczej cząsteczki z plus.

W odniesieniu do statystyki, przy losowej enkapsulacji dla wielkości próbki wynoszącej 517 kropli, średnia frakcja kropli zawierających jedną cząsteczkę wynosi 79,5%, w przeciwieństwie do przewidywanej frakcji enkapsulacji losowej wynoszącej 36,7%. Zaobserwowano, że frakcja cząsteczek, które znalazły się w prawidłowo zamkniętych kroplach, wyniosła 83,7% dla wielkości próbki 491 cząsteczek, podczas gdy frakcja enkapsulacji losowej wyniosła 37,3%. Enkapsulację podwójnych cząsteczek osiąga się po prostu poprzez zmniejszenie szybkości przepływu fazy olejowej do 30 µL/min przy zachowaniu szybkości przepływu fazy wodnej na poziomie dziewięciu µL/min. W tym przypadku lambda, czyli średnia liczba cząsteczek na kroplę, wynosi 1,8. Jest to analogiczne do enkapsulacji pojedynczych cząsteczek.

Odstępy między cząsteczkami w kierunku przepływu wynoszą około 17 do 18 mikronów dla całkowicie uporządkowanych cząsteczek naprzemiennych. Większe krople mają średnią wielkość 39,8 piko-litrów i powstawały z częstotliwością 3,8 kiloherca w porównaniu do przypadkowej enkapsulacji. Dla próby obejmującej 383 krople, średnia frakcja kropli o uporządkowanej enkapsulacji zawierających dwie cząsteczki wynosi 71,5%, w przeciwieństwie do przewidywanej frakcji dla enkapsulacji przypadkowej wynoszącej 26,8%. Zaobserwowano, że frakcja cząsteczek, które znalazły się w prawidłowo enkapsulowanych kroplach, wynosiła 79,5% dla próby 689 cząsteczek, podczas gdy frakcja enkapsulacji przypadkowej wynosiła 33,4%.

Łącznie wyniki te pokazują, że wydajność enkapsulacji pojedynczych i podwójnych cząstek jest ponad dwukrotnie wyższa niż w przypadku enkapsulacji losowej i znacznie zmniejsza liczbę kropel, które nie zawierają pożądanej liczby komórek lub cząstek. Znaczenie odpowiednich stężeń cząstek lub komórek dla wysokiej wydajności enkapsulacji zostało zilustrowane w tym przebiegu eksperymentalnym. Podczas gdy prędkości przepływu fazy olejowej i wodnej są takie same jak w poprzednio pokazanym przebiegu enkapsulacji podwójnej cząstki, średnia liczba komórek na kroplę lambda została zmniejszona do 1,57.

W konsekwencji nie dochodzi do pełnego uporządkowania, przez co w szeregach powstają luki, a w wyniku czego krople zawierają mniej cząstek niż przewidywano. Niniejszy histogram przedstawia obniżoną wydajność enkapsulacji dwóch cząstek ze względu na niższą wartość Lambda. Dla próby obejmującej 324 krople średnia frakcja kropel zawierających dwie cząstki wynosiła 55,9%, przy czym liczba kropel z jedną cząstką była niemal tak samo wysoka, jak liczba kropel z dwiema cząstkami.

Wskazuje to, że wartość Lambda powinna być równa lub zbliżona do pożądanej liczby komórek na kroplę, aby zmaksymalizować liczbę prawidłowo enkapsulowanych cząsteczek lub komórek; dokładną wartość lambdy należy dobrać w zależności od tego, czy dopuszczalna jest mniejsza, czy większa liczba komórek na kroplę. W niniejszej demonstracji wykorzystujemy różnice w wyporności, aby umożliwić kontrolę stężenia w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu. Jednak w przypadku eksperymentów długoterminowych zaleca się dopasowanie wyporności, aby uzyskać bardziej spójne wyniki po enkapsulacji komórek w kroplach wodnych.

Eksperymenty zależne od czasu można przeprowadzać w probówce do wirowania lub pod mikroskopem, poprzez ponowne wstrzykiwanie kropel do macierzy mikroprzepływowych.