LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie proteomiki strzelbowej do scharakteryzowania i ilościowego określenia endogennych produktów deamidacji glutaminy i asparaginy w złożonych proteomach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania biochemiczne, takie jak wpływ spontanicznych i antymatycznych procesorów na izometryczny produkt gluteo deaminacji glutaminy i szparagów. Główną zaletą tej techniki jest to, że izomery deaminacji glutaminy są rozdzielane na długiej kolumnie kapilarnej do zmian jonowych, maksymalizując zdolność do oddzielania peptydów przez punkty izomatyczne.

Aby rozpocząć budowę kolumny, zawieś 50 miligramów słabego materiału uszczelniającego z wymiany anionów w 3,5 mililitra 90% izopropanolu w wodzie. Przymocuj złączkę żeńsko-żeńską, mikrodzik i nakrętkę żeńską na jednym końcu rurki szczytowej o długości 50 centymetrów i średnicy wewnętrznej 200 mikrometrów. Zamontuj ekran 1/16 cala z porami o długości jednego mikrometra na końcu rurki wewnątrz mikrodzikiego.

Używając pompy ciśnieniowej ustawionej na 4 500 psi, umieść wymianę anionów w kapilarze, aż materiał będzie widoczny u góry. Przymocuj kolejną nakrętkę złączkową typu żeńskie, mikrodziką i żeńską do górnej części wypełnionej kapilary na przeciwległym końcu, aby zakończyć montaż kolumny. Przemywać od 50 do 100 miligramów tkanki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami przez pięć minut.

Powtórz to pranie dwukrotnie, a następnie umieść umytą chusteczkę w probówkach z nasadkami zabezpieczającymi. Do każdej probówki dodać jeden równoważnik wagowy kulek ze stali nierdzewnej i 2,5 równoważnika objętościowego wodnego 100-milimolowego roztworu octanu amonu z 1% deoksycholanem sodu. Homogenizować tkankę z maksymalną intensywnością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie odwirować homogenat przez dziesięć minut w temperaturze 10 000 x g i czterech stopniach Celsjusza. Przenieść supernatant do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Kontynuować homogenizację i odwirowywanie osadu tkankowego, łącząc supernatanty za każdym razem, aż do momentu, gdy nie zaobserwuje się żadnego osadu.

Określić ilościowo stężenie białka w połączonych supernatantach za pomocą testu kwasu bicynkowego. Następnie dodać do homogenatu jednomolowy roztwór ditiotreitolu w 100 milimolowym octanie amonu, aby uzyskać dziesięciomilimolowe stężenie ditiotreitolu w próbce. Inkubować homogenat w łaźni wodnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzydzieści minut.

Dodać do homogenatu jednomolowy roztwór jodoacetamidu w 100-milimolowym octanie amonu, aby uzyskać stężenie 20 milimolowego jodoacetamidu w próbce. Inkubować homogenat w temperaturze pokojowej przy braku światła przez 45 minut. Następnie rozcieńczyć homogenat dwoma równoważnikami objętości dziesięciomilimolowego roztworu ditiotreitolu w 100-milimolowym octanie amonu.

Inkubować homogenat w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Dodać do homogenatu wystarczającą objętość zmodyfikowanej trypsyny o stopniu sekwencjonowania w 100-milimolowym octanie amonu, aby uzyskać stosunek wagowy enzymu białkowego 1 do 50. Inkubować próbkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc, aby strawić homogenat.

Stłumić trawienie 0,5% masy próbki kwasu mrówkowego, wytrącając sole deoksycholanu sodu. Delikatnie zwirować próbki zawierające sole SDC, a następnie odwirować próbki przez dziesięć minut w temperaturze 12 000 x g i czterech stopniach Celsjusza. Zdekantować supernatant do nowej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu soli SDC.

Ponownie rozpuść sole w 0,5% objętościowo wodnym roztworze wodorotlenku amonu, energicznie wirując. Kondycjonuj jednogramowy wkład sorbentowy C-18 z 5 mililitrami acetonitrylu, a następnie pięcioma mililitrami 0,1% kwasu trifluorooctowego w wodzie. Następnie załaduj strawioną próbkę do wkładu.

Umyj próbki trzy do pięciu razy pięciomililitrowymi porcjami 0,1% TFA. Następnie rozcieńczyć peptydy pięcioma mililitrami wodnego roztworu 75% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Wysuszyć płyn w koncentratorze próżniowym.

Do pozostałości dodać 200 mikrolitrów 75% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym. Wirować mieszaninę przez co najmniej dziesięć minut, a następnie sonikować mieszaninę przez co najmniej 30 minut, aby rozpuścić suche peptydy. W razie potrzeby rozcieńczyć próbkę, tak aby wstrzykiwana próbka zawierała od jednego do trzech mikrogramów białka.

Podłączyć kolumnę kapilarną LAX do przyrządu do ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Przygotować 0,1% roztwory kwasu mrówkowego w wodzie i acetonitrylu. Ustaw natężenie przepływu na 0,4 mikrolitra na minutę i ustaw 1 200-minutowy przebieg gradientu.

Skonfiguruj zdarzenia skanowania spektrometru mas w celu naprzemiennego pozyskiwania danych między pełną spektrometrią mas z transformacją Fouriera a tandemową spektrometrią mas z transformacją Fouriera. Wykonaj LERLIC MS/MS, aby oddzielić i scharakteryzować peptydy. Użyj uzyskanych danych i oprogramowania proteomicznego, aby przeszukać bazę danych białek.

Eksportuj wyniki wyszukiwania w bazie danych do arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj i wyodrębnij listę peptydów zdeamidowanych i odpowiadających im peptydów niezdeamidowanych. Wyekstrahuj chromatogramy jonowe każdego z tych peptydów z tolerancją masy pięciu części na milion.

Sprawdzić wyekstrahowane chromatogramy jonowe pod kątem oddzielonej iluzji podwójnego piku produktów izomerycznych. Za pomocą LERLIC MS/MS oddzielono zdeamidowane izoformy glutaminy i asparaginy i zidentyfikowano je z próbki białka w dwóch różnych okresach retencji. Zidentyfikowano enzymatycznie zmodyfikowane pośrednie reszty glutaminy transamidacji wykazujące odwrócony stosunek gamma alfa glutamilu.

Za pomocą tej metody zidentyfikowano również produkt pośredni sukcynimidu w pozostałościach asparaginy. Ponieważ umiarkowanie kwaśne warunki przetwarzania próbki stabilizują półprodukt sukcynimidu. Sugeruje to, że technika LERLIC MS/MS może być zastosowana do badania produktów pośrednich sukcynimidu na całym proteomie.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biochemią do scharakteryzowania deamidacji białek w kontekstach od archeologii po badania biomedyczne.