Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Ogólnym celem tej procedury jest porównanie stężeń wielu białek między próbkami za pomocą spektrometrii mas przy użyciu gotowej proteomiki. Osiąga się to poprzez najpierw trawienie białka z każdej próbki w celu wytworzenia mieszanin peptydów. Następnie dwie próbki są mieszane, a peptydy w zmieszanej próbce są frakcjonowane i odsalane.

Następnie wymieszana próbka jest następnie analizowana za pomocą spektrometrii mas. Na koniec peptydy identyfikuje się poprzez porównanie dwóch widm MS z docelową bazą danych wabików wszystkich potencjalnych peptydów w próbkach, a następnie określa się ilościowo względną obfitość peptydów między próbkami. Ostatecznie, gotowa proteomika umożliwia ilościowe określenie względnej obfitości wielu białek w złożonych próbkach.

Główną zaletą demetylacji redukcyjnej w porównaniu z innymi metodami znakowania stabilnych izotopów, takimi jak iLite, jest to, że gotowa jest szybką, niedrogą i dokładną metodą, która nie wymaga specjalnych trois ani podłoża syntetycznego, co oznacza, że można ją zastosować do prawie każdego rodzaju próbki. Na początek przygotuj jeden miligram białka komórkowego i 500 mikrolitrów za pomocą sonikacji lub prasy francuskiej, aby wytrącić komórki w celu wytrącenia białek. Dodaj jedną objętość kwasu trichlorotycznego do czterech objętości białka i schładzaj na lodzie przez 10 minut.

Wirować w temperaturze 12 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant. Następnie użyj jednego mililitra lodowatego acetonu do Resus. Zawieś pellet przed zawirowaniem po raz drugi.

Po zassaniu snatu wysuszyć granulkę w bloku grzewczym o temperaturze 56 stopni Celsjusza, aby zdenaturować białka i zredukować wiązania siarczkowe barwnika. Użyj 500 mikrolitrów buforu denaturującego i redukcyjnego do ponownego użycia. Ponownie zawiesić białka do około dwóch miligramów na mililitr.

Inkubuj białka przez 30 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza, a następnie 10 minut w temperaturze pokojowej. Obok wolnych od alkilatów grup siarczkowych dodaj 25 mikrolitrów świeżo przygotowanego 0,3 molowego acetamidu IDO w wodzie do 500 mikrolitrów białka i inkubuj w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji wygasić reakcję, dodając 10 mikrolitrów trzech milimolowych DTT.

Przechowuj alkilowane białka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby strawić alkilowane białka po wytrąceniu TCA, użyj jednego molowego mocznika w 50 milimolowych heis pH 8,2 w celu ponownego zawieszenia białka. Przygotować roztwór podstawowy lizolu, proteinazy endo lub ly C w wodzie o stężeniu dwóch mikrogramów na mikrolitr i dodać enzym do strawionego białka w końcowym stężeniu 10 nanogramów na mikrolitr próbki pozostawia się w temperaturze pokojowej na sześć godzin lub na noc. Zawiesić 20 mikrogramów trypsyny do sekwencjonowania w 40 mikrolitrach 50-milimolowego kwasu octowego i dodać pięć mikrolitrów do reakcji trawienia liku.

Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza do alkilowanych białek. Dodać kwas trifluoroctowy lub TFA do końcowego stężenia 0,5% Podłączyć kolumnę C 18 do kolektora ekstrakcyjnego. Następnie użyj sześciu mililitrów acetonu nitrylu lub CN do zwilżenia kolumny.

Następnie, przy najwyższym możliwym natężeniu przepływu, użyj sześciu mililitrów 80% CN 0,1% TFA do umycia kolumny przed użyciem sześciu mililitrów 0,1% TFA do zrównoważenia kolumny, zatrzymaj podciśnienie i załaduj 500 mikrogramów peptydów na kolumnę przy natężeniu przepływu około jednego mililitra na minutę. Gdy peptydy zostaną związane z kolumną, uruchom ponownie próżnię i przy najwyższym możliwym natężeniu przepływu użyj 0,1% TFA, a następnie trzech mililitrów buforu kwasu cytrynowego do przemycia kolumny w celu przeprowadzenia onco, redukcji, dim metylacji lub gotowego etykietowania. Pod kapturem chemicznym przygotuj po 12 mililitrów lekkich i ciężkich gotowych bez peptydów Tom Methylate.

A oznacza dodanie 10 mililitrów lekkiego lub ciężkiego gotowego buforu do kolumny z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę. Po zastosowaniu drugiej 10 mililitrowej podwielokrotności. Aby zapewnić etykietowanie, użyj sześciu mililitrów 0,1% TFA, a następnie jednego mililitra 0,5% kwasu octowego.

Aby umyć kolumnę w celu wymycia białek, zatrzymaj próżnię i nałóż jeden mililitr 40% na CN 0,5% kwasu octowego o natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę. Następnie dodaj jeden mililitr 80% elucji kwasu octowego CN 0,5% za pomocą pięciomililitrowej strzykawki, jeśli to konieczne. Wymieszać stosunek jeden do jednego ciężkich i lekko znakowanych próbek peptydów i określić ilościowo za pomocą spektrometrii mas, aby upewnić się, że zarówno znakowanie światłem, jak i znakowanie światłem były skuteczne, frakcjonować mieszaninę peptydów, najpierw nakładając ją na kolumnę HPLC C 18.

Następnie, po użyciu 5% CN do mycia kolumny przez pięć minut, użyj gradientu od pięciu do 35% CN przez 60 minut, aby wymyć peptydy w równych frakcjach. W 96-dołkowej płytce, a następnie 90% CN przez jedną minutę. Po dodatkowych czterech minutach 90% A CN, użyj 5% CN, aby ponownie zrównoważyć kolumnę.

Następnie połącz frakcje w następujący sposób z wirówką próżniową. Usunąć rozpuszczalnik z połączonych frakcji. Następnie użyj 130 mikrolitrów jednego molowego mocznika 0,5% TFA do Resus.

Zawiesić peptydy z kolejnych frakcji i przechowywać zestaw frakcji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu przeprowadzenia, zatrzymania i przejścia ekstrakcji na zawieszonych frakcjach. Przygotuj mikrokolumny końcówek C 18 stage z 200 mikrolitrowych końcówek do pipet, używając dwóch krążków C 18 o średnicy wewnętrznej 1,07 milimetra do ich pakowania. Umieść końcówki stolika w mikroprobówkach wirówkowych, dodaj 130 mikrolitrów metanolu i odwiruj.

Następnie dodaj 130 mikrolitrów 80% kwasu octowego CN 0,5% przed ponownym odwirowaniem po użyciu 130 mikrolitrów 0,1% TFA do zrównoważenia końcówek, przenieś mieszaninę peptydów na końcówki i umyj. Najpierw ze 130 mikrolitrami 0,1% TFA, a następnie 40 mikrolitrami 0,1% TFA. Następnie 40 mikrolitrów 0,5% kwasu octowego w celu wymycia peptydów.

Najpierw dodaj 20 mikrolitrów 40% do CN 0,5% kwasu octowego. Następnie 20 mikrolitrów 80% kwasu octowego CN 0,5%. Połączyć IIT i przesiąknąć próżniowo do wyschnięcia, aby przeprowadzić mikrokapilarną chromatografię cieczową.

Tandemowa spektrometria mas lub L-C-M-S-M-S rozpoczyna się od użycia 5% kwasu mrówkowego, 5% A CN do ponownego zawieszenia białek do stężenia około jednego mikrograma na mikrolitr. Nałóż około jednego mikrograma peptydów na 100 mikrometrów na 20 centymetrów C 18. Kolumnę HPLC z odwróconą fazą i elucję przy użyciu gradientu CN od sześciu do 22% w 0,1 25% kwasie mrówkowym przy natężeniu przepływu około 300 nanolitrów na minutę, podawanym przez 75 do 100 minut.

Użyj spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości i wysokiej dokładności masy i zidentyfikuj peptydy w próbce, porównując surowe pliki Ms.Ms Spectra z teoretyczną bazą danych za pomocą algorytmu takiego jak SE quest, używając pokazanych tutaj parametrów z bazą danych otwartych ramek odczytu w rzeczywistej i odwrotnej orientacji filtruj peptydy do 1% wskaźnika fałszywego wykrywania za pomocą metody takiej jak wabik docelowy. Aby określić ilościowo zidentyfikowane peptydy, należy obliczyć obszary ciężkich i lekkich par chromatogramów jonowych wyekstrahowanych MS one, a stosunek sygnału do szumu peptydu obejmuje pary peptydów tylko wtedy, gdy ich średni stosunek sygnału do szumu jest wyższy niż pięć. Określ ilościowo względną obfitość peptydu w dwóch próbkach jako stosunek obszarów jednego piku MS ciężkich i lekkich wersji tego samego peptydu, oblicz względną obfitość białka jako medianę stosunku MS do jednego obszaru piku dla wszystkich peptydów w białku po przefiltrowaniu do 1% wskaźnika fałszywego wykrywania peptydu.

Skuteczność gotowego znakowania mieszanki c fitofermentacji z ciężkich i lekkich znakowanych kultur, które zawierają 11 194 unikalnych sekwencji peptydowych, wynosiła 98% Podobnie analizowano niefrakcjonowany lizat białka visier. Różnice w ekspresji białek w sposób powtarzalny odzwierciedlają proporcje, w jakich ciężkie i lekkie próbki zostały zmieszane w szerokim zakresie proporcji mieszania. W szczególności zmiana fo 99% białek była mniejsza niż 1,6 dla próbek mieszanych jeden do jednego w próbkach jeden do 10 i 10 do jednego.

99% białek mieściło się w granicach 3,8-krotności oczekiwanego stosunku, wykazując wzrost odchylenia standardowego w większej odległości od mieszaniny jeden do jednego. Po nałożeniu gotowego oznakowania na proteom fitofermentacji Clostridium, ponad 2000 białek oznaczono ilościowo za pomocą 94% białek mierzonych na dwóch poziomach dla replikowanych kultur rosnących na fałdowaniu białka glukozy. Zmiany dla zduplikowanych par kultur były również silnie skorelowane.

Łącznie eksperymenty te potwierdzają, że proteomika Ready jest dokładną i powtarzalną metodą ilościowego określania różnic w ekspresji białek między złożonymi próbkami. Ponieważ technika ta może być stosowana do praktycznie każdego rodzaju próbki, utorowała ona drogę naukowcom w dziedzinie proteomiki do badania zmian ekspresji prote we wszelkiego rodzaju próbkach, w tym w nowych drobnoustrojach, komórkach ryb i ssaków.