Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Ogólnym celem natywnej elektroforezy w połączeniu z testami w żelu, immunoblottingiem i natywną elektroelucją, jest zachowanie i analiza zespołu superkompleksów mitochondrialnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób kompleksy białkowe mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów łączą się w superkompleksy w zależności od wielu czynników, w tym potrzeb bioenergetycznych oraz warunków fizjologicznych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jeśli zostanie wykonana prawidłowo, fizjologiczna integralność i funkcjonalność superkompleksów mitochondrialnych jest zachowana przez cały długi proces izolacji.

Metoda ta może być również stosowana do badania dynamiki składania nadkompleksów oraz do analizy kompleksów białkowych w błonie plazmatycznej, a także w innych błonach wewnątrzkomórkowych. Przygotowując się do testów w żelu, absolutnie ważne jest, aby wszystkie części używane do natywnej elektroforezy nie były zanieczyszczone detergentami, ponieważ przyczynią się one do rozpadu superkompleksów mitochondrialnych. Wytnij jeden lub więcej pasów z przezroczystego natywnego żelu i przenieś je do oznaczonego pojemnika.

Aby wykonać test kompleksu 1, połącz 10 mililitrów buforu testowego z 25 miligramami tetrazolu błękitu nitro i 100 mikrolitrami 10 miligramów na mililitr NADH. Dodaj to do wyciętego przezroczystego natywnego pasa żelowego lub obszaru zainteresowania. Śledź rozwój niebieskich pasków po delikatnym mieszaniu na bujaku przez co najmniej trzy minuty.

Następnie utrwal żel w 10 do 20 mililitrach roztworu kwasu octowego lub przemyj w pięciu milimolowych Tris pH 7,4, aby zatrzymać reakcję. Zrób zdjęcia do dokumentacji. Aby wykonać test kompleksu 5, należy uzyskać żel, pas lub obszar zainteresowania z niebieskiego natywnego lub przezroczystego natywnego żelu.

Inkubować próbkę przez dwie godziny z delikatnym mieszaniem w 10 do 20 mililitrach buforu do oznaczania, plus minus pięć mikrogramów na mililitr oligomycyny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zastąpić bufor 14 mililitrami świeżego buforu do oznaczania. Następnie dodaj kolejno 190 mikrolitrów jednego molowego siarczanu magnezu, 27,28 miligramów azotanu ołowiu, 60 miligramów ATP i 75 mikrolitrów oligomycyny.

Inkubować z delikatnym mieszaniem i obserwować biały osad, ponieważ prążki na żelach traktowanych oligomycyną dadzą pasma zależne od niekompleksu-5. Utrwal żel w utrwalaczu na bazie metanolu, ponieważ kwaśne roztwory rozpuszczą osad ołowiu. Sfotografuj wyniki, a następnie przenieś białko i immunoblotting, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W dniu elektroelucji umieść frytę na dnie każdej szklanej rurki, która ma być użyta. W razie potrzeby umieścić szklaną probówkę w buforze elucyjnym i wepchnąć frytę od środka na dno probówki. Wepchnij szklaną rurkę z frytą do modułu Electro-Eluter.

Zwilżyć przelotkę buforem elucyjnym i wsunąć szklaną rurkę na miejsce. Upewnij się, że górne części szklanych rurek są równe z przelotką. Zamknij puste przelotki korkami.

Następnie umieść mokrą nasadkę membrany na dnie silikonowego adaptera i napełnij adapter buforem elucyjnym. Powoli pipetować bufor i adapter w górę i w dół, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza wokół membrany dializy. Wsuń adapter wypełniony buforem na spód szklanej rurki.

Następnie usuń wszystkie bąbelki, które pojawiają się na frycie wewnątrz szklanej rurki. Napełnij każdą szklaną probówkę buforem elucyjnym. Umieść wycięte paski BN-PAGE w szklanych rurkach.

Pokrój duże kawałki na mniejsze kawałki. Upewnij się, że wysokość napełnienia w szklanej rurce wynosi około jednego centymetra. Następnie umieść cały moduł w zbiorniku.

Dodaj około 600 mililitrów zimnego buforu elucyjnego do zbiornika. Upewnij się, że silikonowe nasadki adaptera są zanurzone w buforze. Umieść mieszadło na dnie zbiornika przed wylucjaniem białek przez cztery godziny przy napięciu 350 woltów w zimnym pomieszczeniu.

Po zakończeniu elucji wyjmij moduł Electro-Eluter ze zbiornika buforowego i umieść go w zlewie lub misce. Jeśli użyto korka, wyjmij go, aby opróżnić górną komorę buforową. Usuń bufor z każdej szklanej probówki i wyrzuć go.

Upewnij się, że silikonowy adapter pozostaje na swoim miejscu, a płyn pod frytą nie jest zakłócony ani wstrząśnięty. Następnie ostrożnie zdejmij silikonowy adapter wraz z nasadką membrany z dna szklanej rurki. Odpipetować zawartość silikonowej nasadki do mikroprobówki.

Za pomocą kolejnych 200 mikrolitrów buforu elucyjnego przepłukać silikonową nasadkę i dodać do mikroprobówki. Powtórz ten proces dla wszystkich szklanych probówek. Zachowaj nasadki membranowe wielokrotnego użytku, umieszczając je w buforze elucyjnym zawierającym 0,5 miligrama na mililitr azydku sodu i przechowuj je w lodówce.

Superkompleksy z mitochondriów serca są tutaj wizualizowane za pomocą testów w żelu. Pasy przezroczystego natywnego żelu są używane do testów w żelu dla kompleksu-1 i kompleksu-5. Specyficzność sygnału można ocenić za pomocą inhibitorów, takich jak oligomycyna dla syntazy ATP.

Testy w żelu dostarczają informacji na temat wielkości kompleksu białkowego o aktywności kompleksu-1 lub kompleksu-5, ale nie na temat ich składu. Niebieski natywny żel pokazuje pasma kompleksów białkowych, które można wyciąć w celu elektroelucji. Po elektroelucji eluat jest używany do dalszej analizy, takiej jak testy w żelu, barwienie srebrem eluowanych białek za pomocą elektroforezy natywnej lub denaturującej oraz Western blot.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Te trzy dni obejmują izolację mitochondriów, wykonanie nocnej niebieskiej natywnej elektroforezy maxi i immunoblotting. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i identyfikować superkompleksy mitochondrialne za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że superkompleksy mitochondrialne są delikatne. Zamrażanie i rozmrażanie próbek powinno być ograniczone do minimum. Natywna elektroforeza i elektroelucja powinny być wykonywane na lodzie lub w chłodni.

Implikacje tych technik wykraczają poza definicję składu fizycznego każdego superkompleksu. Ponieważ superkompleksy są wychwytywane w ich natywnej formie, można przeprowadzić testy funkcjonalne. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią mitochondrialną do ponownej oceny wiedzy na temat aktywności mitochondrialnego transportu elektronów i jej konsekwencji dla pacjentów z chorobami mitochondrialnymi.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak HPLC, spektroskopia mas, mikroskopia elektronowa lub zaciskanie łat, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skład molekularny, struktura lub właściwości elektrofizjologiczne izolowanych kompleksów białkowych.