Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Ogólnym celem tej metody jest wszczepienie myszom rusztowań przenoszących ludzkie komórki w celu stworzenia humanizowanych nisz szpiku kostnego, a następnie zobrazowanie na żywo zachowania komórek ludzkich w implantach. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie układu krwiotwórczego człowieka, ponieważ pozwala na odtworzenie i użycie obrazu w rozdzielczości pojedynczej komórki różnych składników szpiku kostnego. Wszechstronność tego systemu jest jedną z jego głównych zalet, ponieważ umożliwia implantację różnych komponentów niszowych jeden po drugim lub w połączeniu.

Metodologia ta może być potencjalnie zastosowana w innych dziedzinach badań, takich jak badania przesiewowe nad przerzutami nowotworów lub lekami. Stosując odpowiednią sterylną technikę, zacznij od pokrojenia wysterylizowanej gąbki żelatynowej na 24 kawałki o podobnej wielkości. Rusztowania żelatynowe należy rozpuścić przez zanurzenie w etanolu, a następnie w PBS.

Następnie delikatnie przetrzyj każde rusztowanie na sterylnej tkance, aby usunąć nadmiar płynu, i przenieś rusztowania do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki o bardzo niskim mocowaniu. Za pomocą strzykawki insulinowej ostrożnie wstrzyknąć jeden raz od 10 do piątego do jednego razy 10 do szóstego komórek zrębu w 50 mikrolitrach pożywki hodowlanej do każdego rusztowania i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Podczas wstrzykiwania komórek do rusztowania należy upewnić się, że nie ma wycieku z rusztowania.

Po godzinie napełnij każdą studzienkę trzema mililitrami świeżej pożywki do hodowli komórkowych i włóż rusztowania z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach wstrzyknąć jedną raz po 10 do piątej komórki krwiotwórczej do rusztowań, a następnie inkubację i dalsze dodawanie pożywki oraz 24-godzinną inkubację, jak właśnie pokazano. W celu wytworzenia rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości dwa rusztowania nośne, należy umieścić odtworzone rusztowania w indywidualnych studzienkach 96-dołkowej płytki z dnem U i dodać pięć mikrolitrów rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości po dwa do każdego rusztowania.

Następnie przykryj rusztowania 20 mikrolitrami trombiny i 20 mikrolitrami fibrynogenu. W celu chirurgicznego wszczepienia rusztowań bioinżynieryjnych, najpierw ogol obszar operacyjny z tyłu myszy eksperymentalnej i użyj bawełnianej końcówki zanurzonej w rozcieńczonej chlorheksydynie, aby oczyścić odsłoniętą powierzchnię skóry trzy razy w każdym kierunku. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy i skalpela wykonaj nacięcie skóry o długości od 0,5 do 0,7 centymetra od przodu do tyłu i włóż kleszcze pod tkankę podskórną, aby utworzyć kieszonkę.

Włóż rusztowanie głęboko do kieszeni i zamknij nacięcie klejem chirurgicznym. Pozwól wszczepionym rusztunkom rozwijać się przez osiem do 24 tygodni przed eksplantatem. Po dożylnym podaniu substancji fluorescencyjnych i eutanazji zwierząt, należy wysterylizować skórę, jak właśnie pokazano, i wykonać podłużne nacięcie skóry na grzbiecie zwierzęcia, w pobliżu pierwotnego miejsca implantacji.

Ostrożnie oddziel skórę od kieszonki podskórnej, w której wszczepiono rusztowanie, a następnie użyj pęsety, aby delikatnie chwycić rusztowanie i ostrożnie przeciąć pozostałą błonę i tkanki otaczające rusztowanie, aby odzyskać strukturę. Użyj szybko działającego kleju samoprzylepnego, aby przymocować rusztowanie do szalki Petriego o wymiarach 35 na 10 mililitrów. W przypadku dwóch rusztowań morfogenetycznych białka kostnego, przed wypełnieniem płytki PBS, należy użyć mikrowiertła chirurgicznego pod mikroskopem mikrochirurgicznym, aby rozrzedzić powierzchnię kości, umożliwiając wizualizację fluoroforów i uchwycenie obrazów w wysokiej rozdzielczości.

Zachowaj szczególną ostrożność podczas procesu wiercenia, ponieważ grubość kości zwykle różni się w zależności od rusztowania i ważne jest, aby nie naruszyć powierzchni. Napełnij naczynie PBS o temperaturze pokojowej. Aby obrazować rusztowania bioinżynieryjne za pomocą mikroskopii 2-fotonowej, umieść rusztowanie na stoliku mikroskopu konfokalnego i wybierz 20-krotną soczewkę zanurzeniową 1,0 NA.

Następnie w trybie akwizycji oprogramowania do obrazowania zaznacz pole Pokaż narzędzia ręczne. W menu lasera włącz laser 2-fotonowy i pozwól laserowi rozgrzać się i ustabilizować. Gdy laser jest gotowy, w menu ustawień obrazowania aktywuj tryb kanału i przełączaj ścieżkę co klatkę.

W menu ścieżki światła wybierz rozdzielacz świateł drogowych bez kąta i MBS 760 plus. Aktywuj cztery nieuszkodzone detektory i ustaw konfigurację zgodnie ze schematem. W menu kanałów ustaw długość fali lasera na 890 nanometrów, a moc na 50%Ustaw wzorzec wzmocnienia na 500 do 600, przesunięcie cyfrowe na zero, a wzmocnienie cyfrowe na 15 dla każdego kanału.

W trybie akwizycji ustaw odpowiednie parametry, aby uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości bez uszkadzania tkanki i wybielania fluoroforów. Następnie ustaw powiększenie na jeden, aby rozpocząć skanowanie obrazu. Po ustawieniu wszystkich parametrów opuść obiektyw, aż dotknie roztworu soli fizjologicznej, a następnie ręcznie ustaw ostrość obiektywu za pomocą lampy jako źródła światła.

Teraz aktywuj menu Z-stack i wybierz przedostatnią funkcję. Ustaw wymagany odstęp między dwoma sekwencyjnymi warstwami i wybierz opcję na żywo, aby zobrazować skan próbki na żywo, dostosowując wzmocnienie cyfrowe i przesunięcie cyfrowe w razie potrzeby w celu uzyskania optymalnej ekspozycji. Aby wyświetlić wizualizację wielu kanałów w tym samym czasie, wybierz funkcję podziału.

W menu sceny, w trybie na żywo, zeskanuj obraz i zaznacz obszary zainteresowania, takie jak lokalizacja ubytków kostnych. Po zakończeniu skanowania próbki przejdź do pierwszego obszaru zainteresowania i użyj funkcji ustaw pierwszy i ustaw ostatni w trybie na żywo, aby ustawić górną i dolną część stosu 3D Z otaczającego obszar zainteresowania. Następnie ustaw środek, C, i kliknij przycisk rozpocznij eksperyment, aby rozpocząć akwizycję obrazu Z-stack w interesującym Cię regionie.

Po zakończeniu akwizycji zapisz obrazy w wyznaczonym folderze i zeskanuj następny obszar zainteresowania. Na tych reprezentatywnych obrazach można zaobserwować ogólną morfologię różnych rusztowań odzyskanych od myszy z niedoborem odporności NSG osiem tygodni po implantacji. Współsiewanie z ludzkimi komórkami śródbłonka zwiększa unaczynienie rusztowania, podczas gdy dodanie rekombinowanego białka morfogenetycznego ludzkiej kości dwa indukuje tworzenie kości.

Rusztowania te zobrazowane za pomocą żywej mikroskopii 2-fotonowej ujawniają obecność naczyń krwionośnych w rusztowaniach oraz długotrwałe wszczepienie ludzkich komórek krwiotwórczych w miąższ rusztowania. Rusztowania wysiane ludzkimi komórkami śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami zrębu ilustrują udział ludzkich komórek śródbłonka w tworzeniu naczyń w rusztowaniu, co skutkuje mystooką chymeryczną człowieka. Powstawanie tkanki kostnej można uwidocznić za pomocą mikroskopii 2-fotonowej, a także powstawanie ubytków w humanizowanym unaczynieniu w tkance śródkostnej, która bardzo przypomina tkankę śródkostną szpiku kostnego.

Co więcej, w rekombinowanych rusztowaniach nośnych z morfogenetycznego białka kości ludzkiej, morfologia tkanki w rusztowaniu przypomina dojrzały szpik kostny z tkanką tłuszczową, co sugeruje, że ludzkie mezenchymalne komórki zrębu również przyczyniają się do tworzenia tkanki tłuszczowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć wszystkich bioinżynierów i główne rusztowania mysie. Zawsze pamiętaj o utrzymaniu ascetycznego środowiska i zachowaniu szczególnej ostrożności podczas obsługi rusztowań.

Należy pamiętać o ograniczeniach związanych z tą metodą, takich jak chimery ludzko-mysie w tkankach. Pamiętaj, że po zobrazowaniu próbki można wykorzystać do dalszych badań, ponieważ rusztowania mogą być trawione, a co za tym idzie, można z nich pobrać żywe komórki.