Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie in vivo ludzkiej sieci naczyniowej. Osiąga się to poprzez uprzednie hodowlę ludzkich komórek endotelialnych zdolnych do tworzenia kolonii, pochodzących z krwi, oraz ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z szpiku kostnego. Oba typy komórek są następnie mieszane z żelem na bazie kolagenu, który jest wstrzykiwany podskórnie immunodeficyjnej myszy.

Siedem dni później implant jest pobierany i oceniany pod kątem tworzenia ludzkiej sieci naczyniowej. Ostatecznie obecność specyficznych dla ludzi mikro naczyń wewnątrz implantów można zweryfikować za pomocą histologii i immunohistochemii. Główną zaletą tej technologii w porównaniu z metodami takimi jak chirurgiczna implantacja konstruktu jest to, że jest ona prosta i łatwa do przeprowadzenia oraz nie wymaga operacji.

Rozpocznij od rozmrożenia jednej fiolki E CFCs, a następnie niezwłocznie rozcieńcz komórki w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów DMEM. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 1200 RPM przez pięć minut i ponownie zawieś pellet komórkowy w 10 mililitrach ogrzanej pożywki EGM two. Następnie przenieś komórki na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 100 mililitrów pokrytą 1% żelatyną i inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z nawilżaniem.

Następnego ranka należy delikatnie odessać medium oraz wszelkie niezwiązane komórki. Następnie należy nakarmić związane komórki 10 mililitrami świeżego medium E GM two. Proces ten należy powtarzać przez kolejne kilka dni, aż do utworzenia się zgodnej monowarstwy.

Następnie przemyj komórki 10 mililitrami PBS. Zastąp PBS dwiema mililitrami trypsyny z EDTA i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora na pięć minut. Po pięciu minutach, obserwując pod mikroskopem, delikatnie stuknij w płytkę i sprawdź, czy komórki się odłączyły.

Jeśli nie, powtórz krótkie inkubacje przy delikatnym kołysaniu. Po całkowitym odlepieniu komórek dodaj osiem mililitrów pożywki EGM two i przenieś komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Policz komórki, a następnie odwiruj je przy 1200 RPM przez pięć minut.

Następnie wysiej komórki na płytki do hodowli tkankowej pokryte 1% żelatyną, zachowując gęstość siewu 5 000 komórek na centymetr kwadratowy. Inkubuj komórki w pożywce EGM two, wymieniając ją co dwa do trzech dni. Powtarzaj tę procedurę podczas kolejnych pasaży, od czwartego do ósmego pasażu.

Komórki E CFC będą gotowe do użycia. Niniejszy protokół można również wykorzystać do namnażania MSC. W tym celu należy zastąpić pożywkę E GM two pożywką M-S-C-G-M.

Użyj niepowlekanej płytki hodowlanej. Rozpocznij pasaż przy 80% konfluencji i wysiej komórki z gęstością 10 000 komórek na centymetr kwadratowy. To doświadczenie wymaga 800 000 E CFCs oraz 1 200 000 MSCs na jeden implant.

Zazwyczaj jednocześnie przygotowuje się pięć implantów. Aby rozpocząć, odessać pożywkę komórkową z płytek hodowlanych, a następnie przemyć każdą płytkę z komórkami 10 mililitrami PBS. PBS zastąpić dwoma mililitrami trypsyny EDTA i inkubować płytki, delikatnie nimi kołysząc.

Kontroluj komórki pod mikroskopem co dwie do pięciu minut, aż wszystkie całkowicie się oddzielą. Następnie dodaj 8 ml DMEM i zbierz zawiesinę komórkową. W probówce stożkowej o pojemności 15 ml policz komórki i przenieś odpowiednią liczbę komórek dla pięciu implantów do osobnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.

Następnie odwiruj komórki przy 1200 RPM przez pięć minut i odlej nadsącz. Ostrożnie przygotuj na lodzie mieszaninę fibrynogenu i kolagenu z fibronektyną. Następnie bardzo delikatnie resuspenduj osad komórkowy w schłodzonej do temperatury lodowej mieszaninie.

Unikając powstawania pęcherzyków powietrza, przenieś zawiesinę komórek do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj igłę o rozmiarze 26 G z nasadką. Przechowuj napełnioną strzykawkę w lodzie do momentu wstrzyknięcia mieszaniny komórek. Znieczulone zostały cztery sześciotygodniowe immunodeficyjne myszy nagi athymic przy użyciu komory z izofluranem.

Po znieczuleniu myszy i stwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca, przystąp do iniekcji każdego zwierzęcia. Używając igły o rozmiarze 30 G, wstrzyknij 50 µL roztworu trombiny podskórnie w górną część grzbietu. W tym samym miejscu wstrzyknij 200 µL mieszaniny komórkowej.

Po użyciu igły o rozmiarze 26 G, wstrzyknięte makrocząsteczki ulegną żelowaniu, tworząc pod skórą niewielki, lecz wyraźnie wyczuwalny guzek. Po iniekcji umieść myszy na warstwie gazy, aby zapewnić im komfort i ciepło. Obserwuj zwierzęta do momentu, aż odzyskają zdolność poruszania się.

Przez następne trzy dni codziennie obserwuj ogólny stan zdrowia zwierzęcia. Tydzień po iniekcjach przeprowadź eutanazję myszy za pomocą dwutlenku węgla i chirurgicznie usuń wtyczkę żelową. Po wyjęciu sfotografuj wtyczki żelowe obok linijki, a następnie umieść każdą wtyczkę żelową w kasecie histologicznej i zanurz je w 10% neutralnej buforowanej formalinie na noc w temperaturze pokojowej.

Następnego dnia wypłucz 10% neutralny bufor forminy wodą destylowaną. Przechowuj kasety w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu przeprowadzenia oceny histologicznej. Wykonaj przekroje o grubości siedmiu mikronów z implantu zatopionego w parafinie.

Następnie należy określić gęstość mikronaczyni w środkowej części implantów. Przy użyciu barwienia H&E należy ocenić liczbę naczyń na milimetr kwadratowy, aby wykazać ludzką naturę naczyń mikronaczyniowych. Przekroje należy zbarwić dostępnym komercyjnie przeciwciałem anty-ludzkim CD 31 w rozcieńczeniu 1:100.

Ten obraz w kontraście fazowym przedstawia charakterystyczną morfologię przypominającą brukowanie komórek śródbłonknych w typowej konfluencyjnej monowarstwie eCFCs pochodzących z krwi pępowinowej. Ten obraz przedstawia typową wrzecionowatą morfologię MSCs pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego. Po tygodniowej inkubacji w organizmie myszy, implant zaznaczony żółtą przerywaną linią wyglądał przy większym powiększeniu zupełnie inaczej niż tkanki gospodarza.

Wykazano obecność wielu mikronaczyń, których struktury luminalne zawierają erytrocyty i są zaznaczone żółtymi grotami strzałek. Podczas badania immunohistochemicznego czopów, światło mikronaczyń wykazało reaktywność na przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu CD 31. Jądra komórkowe przeciwbarwiono hematyną.

Po opanowaniu tej technologii, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu jednej uncji.