Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans
26 listopada 2017
Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie zmian w nierozpuszczalności białek wraz z wiekiem u C. elegans i ocena, w jaki sposób ukierunkowany knockdown genu wpływa na ten marker starzenia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się i proteostazy, takie jak to, dlaczego organizmy nie utrzymują zdrowego proteomu wraz z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania agregacji białek podczas normalnego starzenia się przy braku procesów chorobowych.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat agregacji białek u C. elegans, można ją również zaadaptować do innych organizmów modelowych, na przykład do badania nierozpuszczalności białek związanych z wiekiem u myszy. Aby rozpocząć leczenie, dodać 207,45 mililitrów pożywki S Basal z dodatkowymi odczynnikami, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2 800 mililitrów. Dodać końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr karbenicyliny i jeden milimol IPTG i zamknąć kolbę zakrętką membranową.
Wyjmij L1 z inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza i przenieś je do 15-mililitrowych probówek. Odwirować L1 przy 1 900 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant.
Pod mikroskopem policz L1 na dwa mikrolitry i uśrednij liczby uzyskane z co najmniej dziewięciu kropli. Następnie dodaj 50 000 robaków do kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków do kolekcji starych robaków do czterech kolb hodowlanych Fernbacha przygotowanych w poprzednim kroku. Następnie dodaj kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla interesującego genu proporcjonalnie do liczby robaków.
Po dodaniu bakterii uzupełnij hodowlę robaków za pomocą S Basal, aby uzyskać całkowitą objętość do 300 mililitrów. Inkubować kulturę robaków w temperaturze 25 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min, aż do zbioru. Zbierz młode robaki w drugim lub trzecim dniu, aby zmierzyć podstawowy poziom rozpuszczalności białka.
Wlej robaki z jednej kolby do lejka rozdzielającego i pozwól robakom osiadać przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po osadzeniu się robaków otwórz kurek odcinający i wlej robaki do jednej 50-mililitrowej tuby. Następnie podziel granulkę robaka na dwie 15-mililitrowe rurki.
Napełnij probówki do 15 mililitrów M9 i odwiruj robaki. Aby umyć robaki, usuń supernatant i napełnij probówkę do 15 mililitrów M9. Powtórzyć wirowanie. Po zakończeniu mycia przenieś robaki do dwóch 50-mililitrowych tubek i użyj lodowatego M9, aby napełnić całkowitą objętość do 20 mililitrów.
Aby usunąć bakterie i martwe robaki, dodaj dwie 20-mililitrowe rozcieńczone granulki robaków do dwóch 50-mililitrowych probówek wypełnionych 20 mililitrami lodowatej 60% sacharozy. Szybko odwiruj probówki. Za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów ostrożnie usuń do 15 mililitrów górnej warstwy robaka.
Umieść górną warstwę robaka bezpośrednio w 37 mililitrach M9 plus octoxynol-9 przygotowanych na lodzie. Następnie odwiruj probówki pod ciśnieniem 2700 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przyspieszeniu dziewiątym i zwalnianiu siódmym. Po odrzuceniu supernatantu przenieść osad do czterech 15-mililitrowych probówek i przemyć je dwukrotnie lodowatym M9 plus okoksynol-9.
Następnie odwiruj probówki. Usuń supernatant i napełnij probówki do oznaczenia 15 mililitrów lodowatym M9 plus okoksynol-9. Umyj robaki lodowatym M9 i połącz cztery probówki w dwie tubki.
Napełnij probówki do 15 mililitrów i odwiruj. Usunąć supernatant, napełnić dwie probówki M9 w temperaturze pokojowej do całkowitej objętości czterech mililitrów i obracać je na mieszalniku nutującym w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 40 minut. Po nutowaniu umyj robaki dwukrotnie lodowatym M9 i oktoksynolem-9.
Następnie umyj je dwukrotnie M9 i przenieś robaki do jednej tubki. Przed zebraniem umyć robaki w ponownym montażu lub buforze do ekstrakcji soli o wysokiej zawartości soli RAB bez inhibitorów. Usunąć supernatant do momentu, gdy na wierzchu osadu robaka nie będzie płynu.
Następnie oszacuj objętość osadu robaka i dodaj identyczną objętość RAB z inhibitorami. Przygotuj 50-mililitrową probówkę wypełnioną do połowy ciekłym azotem na suchym lodzie i za pomocą pipety Pasteura wyciągnij robaki i powoli wlej je do probówki. Pozwól ciekłemu azotowi odparować i przechowuj zamrożone robaki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej obróbki.
Schłodzić zaprawę ciekłym azotem i przeprowadzić rozbijanie zwierząt na suchym lodzie. Zamrożone robaki przenieś do wstępnie schłodzonej zaprawy i miel je przez 2,5 minuty. Dodaj 100 mililitrów ciekłego azotu do proszku i miel przez kolejne 2,5 minuty.
Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy ciała robaków są połamane na małe kawałki. Następnie przenieś proszek do dwóch mililitrowych probówek i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Na suchym lodzie odważ dwa razy 350 miligramów zmielonych robaków na punkt czasowy i na bakterie RNAi do dwumililitrowych probówek.
Aby usunąć białka rozpuszczalne o wysokiej zawartości soli, dodaj dwie objętości na wagę już przygotowanego RAB z inhibitorami, jeden milimolowy PMSF, 200 jednostek na mililitr DNazy I i 100 mikrogramów na mililitr RNazy A do każdej probówki i rozpuścić proszek na lodzie. Pobrać zawiesinę do strzykawki o pojemności jednego mililitra 15 razy i inkubować na lodzie przez 10 minut. Wirować w temperaturze 18, 400 razy g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Przejdź przez warstwę tłuszczu i zbierz supernatant zawierający białka rozpuszczalne w soli do jednej dwumililitrowej probówki na warunek. Usuń tłuszcz i wyrzuć go. Podwielokrotność białek rozpuszczalnych w soli do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Aby odrzucić lipidy, należy rozpuścić osad w 700 mikrolitrach RAB z inhibitorami zawierającymi jedną sacharozę molową bez DNazy I i RNazy A. Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować na lodzie przez pięć minut. Pamiętaj, aby usunąć cały sklaranty i lipidy i wyrzucić je. Aby usunąć białka rozpuszczalne w SDS, rozpuść osad za pomocą 700 mikrolitrów buforu RIPA.
Pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy i inkubować przez 10 minut na lodzie. Wirować w temperaturze 18, 400 g przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający białka rozpuszczalne w SDS i podwielokrotność do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Po rozpuszczeniu każdej granulki należy zebrać razem dwie próbki każdego stanu za pomocą 500 mikrolitrów buforu RIPA i pobrać zawiesinę do strzykawki 10 razy. Należy uważać, aby usunąć cały supernatant i wyrzucić go. Końcową osadkę zawierającą wysoce nierozpuszczalne białka rozpuścić w 400 mikrolitrach 70% kwasu mrówkowego i pobrać zawiesinę do strzykawki 20 razy.
Inkubować zawiesinę przez 20 minut na lodzie. Odwiruj zawiesinę w probówkach ultrawirówek, aby usunąć resztki naskórka robaka. Zebrać supernatant zawierający wysoce nierozpuszczalne białka i zamrozić go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Barwienie białka całkowitego zawartości białka nierozpuszczalnego u młodych i starszych robaków wykazało związany z wiekiem wzrost poziomu wysoce nierozpuszczalnego białka u zwierząt kontrolnych, a nie u zwierząt długowiecznych. Barwienie przeciwciałami PAB-1, białka wiążącego RNA z przewidywaną domeną podobną do prionów, potwierdziło dane ze spektrometrii mas, że długowieczne zwierzęta utrzymywały PAB-1 rozpuszczalny z wiekiem. Przeprowadzono analizę in vivo zwierząt transgenicznych wykazujących ekspresję tagRFP PAB-1 w mięśniach gardła.
U młodych zwierząt tagRFP PAB-1 był głównie rozlany w całym gardle. Z wiekiem postępuje akumulacja jasnych puncta rozpoczynających się w tylnej opuszki gardłowej. Podczas starzenia się zaobserwowaliśmy również agregację w przedniej opuszki gardłowej u coraz większej liczby zwierząt.
Kwantyfikacja różnych poziomów agregacji tagRFP PAB-1 wraz z wiekiem w tle dzikiego typu i zmutowanego daf-2 ujawnia silnie opóźnioną agregację tagRFP PAB-1 wraz z wiekiem u zwierząt długowiecznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zebrać dużą liczbę robaków do ekstrakcji białek i jak wyizolować wysoce nierozpuszczalne duże agregaty do dalszej analizy za pomocą spektrometrii mas lub strony SDS.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje agregację białek podczas normalnego starzenia się w organizmie modelowym C. elegans. Metoda ta umożliwia badanie nierozpuszczalnych agregatów białkowych oraz wpływu proteostazy na proces starzenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad starzeniem się
Wstęp
- Agregacja białek jest kluczowym markerem starzenia się.
- C. elegans służy jako cenny organizm modelowy do badania starzenia się.
- Zrozumienie proteostazy jest kluczowe dla uzyskania wglądu w choroby związane z wiekiem.
- Metodę tę można dostosować do zastosowania w innych organizmach, takich jak myszy.
Cel badania
- Wykrycie zmian w nierozpuszczalności białek wraz z wiekiem u C. elegans.
- Ocena wpływu ukierunkowanego wyciszania genów na agregację białek.
- Wyjaśnienie przyczyn trudności organizmów w utrzymaniu zdrowego proteomu podczas starzenia się.
Zastosowane metody
- Przygotowanie pożywki S Basal z konkretnymi odczynnikami.
- Zastosowanie karbenicyliny i IPTG w procesie hodowli.
- Monitorowanie agregacji białek w czasie.
- Zastosowanie technik wyciszania genów w celu oceny wpływu na markery starzenia.
Główne wyniki
- Identyfikacja wzorców agregacji białek podczas starzenia się C. elegans.
- Ocena wpływu wyciszenia genów na rozpuszczalność białek.
- Wgląd w mechanizmy utraty proteostazy wraz z wiekiem.
- Potencjał do szerszego zastosowania w badaniach nad starzeniem się różnych gatunków.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia solidne ramy dla badania agregacji białek związanej ze starzeniem się.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia procesu starzenia oraz proteostazy.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć to podejście na inne organizmy modelowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Badanie naturalnej agregacji białek podczas normalnego starzenia się organizmu dostarcza niezależnych od konkretnych jednostek chorobowych ram dla oceny mechanizmów proteostazy istotnych dla walidacji celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych. Podejście to umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do hipotez łączących rozpuszczalność białek z pogorszeniem funkcji w starzejących się populacjach. Uzyskane spostrzeżenia wspierają wczesne decyzje w procesie odkrywania leków poprzez identyfikację modyfikatorów genetycznych, które utrzymują integralność proteomu bez polegania na ektopowych modelach chorobowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Badanie hipotez terapeutycznych dotyczących genów, które promują lub zapobiegają zależnej od wieku nierozpuszczalności białek.
- Wartość operacyjna: Wykorzystanie ilościowej spektrometrii mas lub analizy z użyciem przeciwciał do szczegółowego zbadania funkcji genów w szlakach agregacji.
- Wartość prognostyczna: Identyfikacja celów, których modulacja opóźnia agregację, co wspiera selekcję projektów w portfelu w oparciu o pewność mechanistyczną.
Przesiewanie i opracowanie testów
- Gotowość testu: Przygotowanie populacji nicieni o zsynchronizowanym wieku w celu uzyskania powtarzalnych frakcji białek nierozpuszczalnych do screeningu związków.
- Wynik ilościowy: Pomiar zmian w wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatach jako funkcjonalny odczyt modulacji proteostazy.
- Skalowalność: Umożliwienie prowadzenia hodowli nicieni na dużą skalę oraz izolacji biochemicznej w celu spójnej oceny związków w różnych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Powiązanie inherentnych mechanizmów agregacji z białkowymi chorobami wieku bez zakłóceń wynikających z ekspresji transgenów chorobowych.
- Ciągłość translacyjna: Walidacja wyników in vivo przy użyciu białek podatnych na agregację, znakowanych fluorescencyjnie, w celu potwierdzenia wyników biochemicznych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wykorzystanie opóźnienia agregacji u długowiecznych mutantów jako biomarkera zaangażowania celu i poprawy proteostazy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy badawcze od wczesnych etapów odkrywania leków po fazę przedkliniczną, dostarczając ilościowy, genetycznie modyfikowalny odczyt spadku proteostazy, co ułatwia identyfikację wiodących związków oraz priorytetyzację celów terapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu wyciszania genów na inherentną agregację, wyjaśniając zaangażowanie konkretnych szlaków w nierozpuszczalność związaną ze starzeniem.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów opartych na izolacji nierozpuszczalnych białek, oferując zestandaryzowany, ilościowy fenotyp do oceny związków lub modulatorów genetycznych.
- Analityka: Generuje dane z spektrometrii mas i immunoblottingu w celu porównania profili nierozpuszczalnych białek w różnych warunkach, co umożliwia obiektywne porównanie interwencji.
- Badania translacyjne: Łączy biochemiczne dane o agregacji z tworzeniem się punktów (puncta) in vivo w modelach transgenicznych, wspierając dopasowanie biomarkerów i walidację mechanistyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny modyfikatorów proteostazy w odniesieniu do wielu celów i obszarów terapeutycznych związanych ze starzeniem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez rozróżnienie genetycznych czynników sprzyjających agregacji od czynników ją zapobiegających.
- Wartość operacyjna: Umożliwia zestandaryzowaną i powtarzalną izolację białek o wysokim stopniu nierozpuszczalności, co pozwala na porównywanie danych międzyfunkcyjnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w programach ukierunkowanych na proteostazę.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zdolność do utrzymywania rozpuszczalności białek podczas starzenia się.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli C. elegans, synchronizacji wieku oraz technik frakcjonowania biochemicznego.
- Zależy od dostępu do ultrawirowania, spektrometrii mas oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu analizy agregatów.
- Wymaga standaryzacji protokołów zbierania i lizy nicieni pomiędzy laboratoriami, aby zapewnić powtarzalną wydajność białek nierozpuszczalnych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody frakcjonowania biochemicznego przy przenoszeniu jej na inne systemy modelowe, takie jak tkanki mysie.
- Ograniczony przez zapotrzebowanie na dużą liczbę nicieni oraz wydłużony czas hodowli w przypadku kolekcji starszych osobników, co wpływa na przepustowość.
FAQ dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Liquid Culture for Treatment with RNAi Starting at L1
2:40
Collection of Young and Aged Worms Subjected to RNAi in Liquid Culture
6:14
Disruption of Animals
6:58
Isolation of SDS-insoluble Proteins for Mass Spectrometry
10:03
Results: Reduced IIS Prevents Age-dependent Protein Aggregation
11:26
Conclusion
