Prosty i tani test do pomiaru ambulacji w mysich modelach dystrofii mięśniowej
29 grudnia 2017
Ten protokół opisuje elastyczny, tani system do pomiaru ruchu myszy w teście aktywności w otwartym polu. Pokazujemy, że 6-minutowy test ambulacyjny oparty na tym systemie wykrywa spadek dobrowolnego ruchu u myszy mdx i dokładnie rozróżnia poprawę w ratowaniu tych zwierząt specyficznym dla mięśni
.Ogólnym celem tego testu jest pomiar dobrowolnej lokomocji w mysich modelach dystrofii mięśniowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dystrofii mięśniowej dotyczące postępu osłabienia mięśni w mysich modelach dystrofii mięśniowej oraz skuteczności potencjalnych terapii. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona nieinwazyjny i powtarzalny pomiar aktywności zwierząt, który można łatwo dostosować do wielu różnych warunków badawczych.
W cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze, o stałej porze dnia, umieść kamerę na drucianej siatce nad komorą aktywności, aby umożliwić rejestrację całej areny, a następnie zdezynfekuj komorę. Bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji aktywności pozwól myszy chwycić pręt cyfrowego miernika siły i delikatnie odciągnij zwierzę, aż pręt zostanie zwolniony. Zapisz wartość szczytowego naciągu w Newtons dla każdej próby.
Z zachowaniem jednej minuty przerwy między próbami. Bezpośrednio po badaniu siły chwytu umieść mysz w komorze i rozpocznij nagrywanie wideo, pozwalając zwierzęciu na swobodną eksplorację. Po sześciu minutach przerwij nagrywanie i przenieś mysz z powrotem do klatki domowej.
W celu przeprowadzenia analizy śledzenia danych wideo, najpierw otwórz nagranie w odpowiednim oprogramowaniu do edycji wideo i ustaw prędkość na dwukrotność prędkości oryginalnej. Wyeksportuj zredukowane wideo w formacie pliku mp4 do analizy śledzenia, a następnie otwórz ten plik w odpowiednim programie do analizy wideo. Aby przeprowadzić kalibrację nagrania wideo, użyj narzędzia linii, aby narysować linię wzdłuż jednej z krawędzi komory.
Kliknij prawym przyciskiem myszy na linii, wybierz kalibruj pomiar i wprowadź rzeczywisty wymiar boku komory w centymetrach. Aby rozpocząć półautomatyczne śledzenie pozycji myszy, kliknij kursor przesuwania. Zaczynając od pierwszej klatki wideo, kliknij prawym przyciskiem myszy w punkt, który ma być śledzony.
Punkt śledzenia zostanie oznaczony niebieskim okręgiem. Aby przejść do następnej klatki, należy użyć prawej strzałki na klawiaturze. Punkt śledzenia powinien przemieszczać się automatycznie w zależności od położenia nasady ogona.
Jeśli pozycja śledzenia nie jest wyrównana z punktem zainteresowania w danej klatce, należy ręcznie dopasować niebieski okrąg do pozycji śledzenia. Po prześledzeniu całego filmu należy zapisać wideo oraz nakładkę śledzenia, a następnie wybrać opcję eksportu do arkusza kalkulacyjnego, aby wyeksportować dane pozycyjne śledzenia. Zgodnie z wynikami raportowanymi w podobnych testach, myszy mdx z brakiem dystrofiny, poddane protokołowi ćwiczeń bezpośrednio przed badaniem, wykazują znacznie mniejszą aktywność ruchową w sześciominutowym teście otwartego pola niż zwierzęta typu dzikiego.
Rzeczywiście, po lekkim wysiłku w teście siły chwytu, myszy mdx zazwyczaj pozostawały w bezruchu przez pierwsze kilka minut protokołu ambulacji, wykazując niewielki wzrost aktywności w czwartej i piątej minucie. Jednak w przypadku porównania zwierząt typu dzikiego i myszy mdx bez obciążenia wysiłkowego nie stwierdzono różnic w przebytej odległości. Myszy mdx transgeniczne pod kątem ekspresji utrofiny są nieodróżnialne od zwierząt typu dzikiego, bez istotnych różnic w całkowitej przebytej odległości ani w żadnym z obserwowanych skumulowanych punktów czasowych.
Aby określić wpływ zmniejszenia częstotliwości próbkowania, zmierzono całkowity dystans przebyty w ciągu jednej minuty nagrania w pełnej liczbie klatek na sekundę, a następnie porównano go z pomiarami dystansu uzyskanymi z wersji zestawu danych o obniżonej częstotliwości próbkowania. Zmniejszenie liczby klatek na sekundę o połowę spowodowało spadek zmierzonego dystansu o 5% w stosunku do pierwotnie obliczonej wartości. Po tym punkcie dokładność pomiaru dystansu gwałtownie spada, choć nawet silnie zdyskontowane zestawy danych nadal ściśle przybliżają ścieżkę zwierzęcia. Podkreśla to znaczenie uwzględnienia liczby klatek na sekundę oraz przetwarzania sygnałów przy ocenie aktywności zwierząt i wykazuje, że w danych wideo o obniżonej częstotliwości próbkowania można zachować wysoką rozdzielczość przestrzenną.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu rejestracji i analizy ambulacji myszy w warunkach otwartego pola. Po opanowaniu tej metody, analiza może zostać przeprowadzona w ciągu 15 do 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ten niedrogi i nieinwazyjny test pozwala badaczom na ocenę aktywności motorycznej w modelach mysich dystrofii mięśniowej i może służyć jako informacyjny pierwszy krok do dalszych pomiarów funkcjonalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje elastyczny, niskokosztowy system pomiaru aktywności ruchowej myszy w teście otwartego pola. Metoda ta zapewnia nieinwazyjny i powtarzalny pomiar aktywności zwierząt, który może być dostosowany do różnych warunków badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad dystrofią mięśniową
- Analiza behawioralna
Wstęp
- Test ten mierzy dobrowolną ambulację w mysich modelach dystrofii mięśniowej.
- Odpowiada on na kluczowe pytania dotyczące progresji osłabienia mięśni.
- Technika ta została zaprojektowana w celu oceny skuteczności potencjalnych terapii.
- Rejestracja odbywa się w kontrolowanym środowisku, aby zapewnić spójność wyników.
Cel badania
- W celu pomiaru ruchów dobrowolnych u myszy mdx.
- W celu oceny wpływu interwencji specyficznych dla mięśni.
- W celu uzyskania informacji na temat progresji dystrofii mięśniowej.
Zastosowane metody
- Użycie kamery umieszczonej nad komorą aktywności do rejestracji.
- Czyszczenie komory środkiem dezynfekcyjnym przed próbami.
- Umożliwienie myszy uchwycenia się drążka w celu pomiaru szczytowego napięcia.
- Rejestracja aktywności podczas 6-minutowego testu ambulacyjnego.
Główne wyniki
- System wykrywa spadki w dobrowolnej aktywności ruchowej u myszy mdx.
- Dokładnie odróżnia on poprawę wynikającą ze specyficznego dla mięśni ratunku fenotypu.
- Wyniki są powtarzalne w różnych próbach.
- Metoda ta jest możliwa do dostosowania do różnych warunków badawczych.
Wnioski
- Ten test jest skuteczny w badaniu dystrofii mięśniowej u myszy.
- Dostarcza on cennych danych na temat skuteczności potencjalnych metod leczenia.
- Podejście to jest elastyczne i może być wykorzystywane w różnych środowiskach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar dobrowolnego chodzenia w modelach mysich dostarcza translacyjnych danych dotyczących funkcji motorycznych w dystrofii mięśniowej, będąc bezpośrednim odpowiednikiem punktów końcowych stosowanych w klinice, takich jak 6-minutowy testy chodzenia. Ten niskokosztowy test oparty na analizie wideo umożliwia powtarzalną, nieinwazyjną ocenę progresji choroby oraz odpowiedzi na terapię w badaniach przedklinicznych. Dzięki wykrywaniu deficytów aktywności u myszy mdx z brakiem dystrofiny oraz ich niwelowaniu poprzez ekspresję utrofiny, metoda ta wspiera walidację celów terapeutycznych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w chorobach nerwowo-mięśniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez kwantyfikację dobrowolnej ambulacji jako funkcjonalnego wskaźnika siły mięśni w modelach dystroficznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka dzięki powtarzalnej korelacji genotypowo-fenotypowej u myszy mdx w porównaniu z kohortami typu dzikiego oraz kohortami po ratunku fenotypu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez odróżnianie skutecznych interwencji (np. transgen utrofiny), które normalizują poziom aktywności do poziomu typu dzikiego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu związków z wykorzystaniem znormalizowanych wskaźników ambulacji w otwartym polu.
- Powtarzalność: Dostarcza ilościowe wyniki w zakresie dystansu i czasu, umożliwiając standaryzację analizy pomiędzy różnymi laboratoriami.
- Skalowalność: Wykorzystuje bezpłatne oprogramowanie open-source oraz dostępny sprzęt, co pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w różnych warunkach badawczych bez konieczności posiadania specjalistycznego wyposażenia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje istotne dla pacjentów deficyty w chodzeniu, zapewniając ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala ustalić, czy obserwowane efekty wynikają z ratunku specyficznego dla mięśni, czy z nieswoistych zmian aktywności.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Informuje kryteria go/no-go poprzez korelację powrotu zdolności do chodzenia z zaangażowaniem celu i modulacją szlaku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, stanowiąc funkcjonalny pomost między mechanizmami molekularnymi a efektami fenotypowymi w modelach dystrofii mięśniowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych z mierzalnymi zmianami w ruchach dobrowolnych.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki powtarzalnemu śledzeniu opartemu na wideo, które generuje mierzalne punkty końcowe ambulacji do oceny związków.
- Analityka: Generuje strumienie danych pozycyjnych i czasowych, które pozwalają zespołom porównywać aktywność lokomotoryczną w zależności od genotypów, zastosowanych terapii i punktów czasowych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez odzwierciedlenie klinicznych ocen ambulacji, co ułatwia dopasowanie biomarkerów i modelowanie predykcyjne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość wielokrotnego wykorzystania niskokosztowej metody testowania ambulacji, co zmniejsza zależność od specjalistycznych placówek centralnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w testach funkcji motorycznych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i odtwarzalność dzięki wykorzystaniu śledzenia open-source oraz kontrolowanych warunków środowiskowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wyeliminowanie potrzeby stosowania kosztownych systemów śledzenia ruchu przy zachowaniu jakości danych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju skorygowanych o ryzyko, w oparciu o funkcjonalne przywrócenie fenotypów chodu w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy w zakresie rejestracji wideo oraz obsługi oprogramowania do śledzenia typu open-source (np. ręcznego dopasowania klatka po klatce).
- Zależy od standardowego sprzętu obrazującego i stałych warunków środowiskowych (oświetlenie, temperatura, pora dnia).
- Wymaga przestrzegania protokołu przez wszystkie zespoły w celu zapewnienia powtarzalności wyników w różnych ośrodkach i przez różnych operatorów.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów do różnych rozmiarów komór, szczepów myszy oraz poziomów aktywności.
- Wiąże się z kompromisem między częstotliwością klatek a dokładnością pomiaru, ponieważ undersampling zmniejsza precyzję obliczeń odległości.
