Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami
13 kwietnia 2018
Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.
Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie prostej metody generowania i izolowania komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami. Metoda ta może dostarczyć odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad aneuploidią, takie jak interakcja układu odpornościowego z komórkami aneuploidalnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona populację komórek, która zawiera tylko złożone kariotypy.
Aby rozpocząć synchronizację komórek RPE-1 hTERT, użyj świeżo rozmrożonych komórek i dozuj je do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej przy użyciu ośmiu mililitrów standardowej pożywki wzrostowej. Następnie użyj hemocytometru, aby określić numer komórki. Następnie inkubuj komórki przez noc.
Następnego dnia zastąp standardową pożywkę wzrostową pożywką zawierającą pięciomilimolową tymidynę. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zsynchronizować komórki na granicy G1S. Po 24 godzinach umyj komórki trzykrotnie PBS.
Następnie dodaj standardową pożywkę wzrostową do umytych komórek i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Najpierw umyj komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać pożywkę zawierającą 500 nanomolowych inhibitorów Mps1 Replican.
Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki trzykrotnie PBS. Następnie dodaj standardowe podłoże wzrostowe i włóż płytki z powrotem do inkubatora.
Około 72 godziny po pierwszej nieprawidłowej mitozie umyj komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać pożywkę zawierającą 330 nanomolowych nokodazolu. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odessać pożywkę z nokodazolem. Następnie dodaj trzy mililitry PBS do naczynia i postukaj w bok płytki, aby strząsnąć komórki mitotyczne. Obracaj płytkę między każdym kranem, aby umożliwić równomierne usunięcie komórek mitotycznych.
Po wstępnym strząśnięciu należy zassać płyn przylegający do pokrywki i krawędzi płytki. Następnie sprawdź płytkę pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu. Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami PBS.
Następnie dodać pożywkę zawierającą 330 nanomolowych nokodazolu. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ostatnim otrząśnięciu dodaj 10 mililitrów standardowej pożywki wzrostowej.
Inkubować komórki przez 12 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wykonaniem testów. Komórki pozostające na płytce są określane jako zatrzymane ze złożonym kariotypem lub komórkami ArCK. Protokół ten opisuje prostą metodę izolowania komórek ArCK, a kilka cech specyficznych dla komórek ArCK jest analizowanych w celu potwierdzenia ich izolacji.
Komórki ArCK wykazują podwyższony poziom inhibitorów cyklu komórkowego p53, p21 i p16 w analizie immunoblot, podczas gdy komórki eupoidalne i aneuploidalne nie. Ponadto komórki ArCK są dodatnie pod kątem beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się, która barwi się na niebiesko-zielono, podczas gdy euploidalne komórki kontrolne nie. Wykresy segmentacji ujawniają, że komórki ArCK są aneuploidalne, charakteryzujące się wielokrotnymi, losowymi przyrostami chromosomów i utratą chromosomów.
Wykresy segmentacji pokazują liczbę kopii pojedynczych komórek od chromosomu pierwszego do X w stosunku do euploidalnej skali referencyjnej log dwa. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby upewnić się, że usunąłeś wszystkie komórki mitotyczne podczas każdego otrząsnięcia. Po wykonaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak oznaczanie cytokin
.Testy te pomogą w udzieleniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zdolność komórek ArCK do interakcji z komórkami układu odpornościowego. Nie zapominaj, że nokodazol jest niebezpieczny. Podczas stosowania tego odczynnika należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do skutecznego izolowania komórek ArCK in vitro. Tę procedurę można wykonać w ciągu siedmiu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia prostą metodę izolacji komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które znajdują się w stanie zatrzymania cyklu komórkowego. Technika ta ma na celu pogłębienie wiedzy na temat aneuploidii oraz jej wpływu na zachowanie komórek i interakcje immunologiczne.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Genetyka
- Neuronauka
Wprowadzenie
- Aneuploidia wiąże się z niestabilnością genomu.
- Komórki o złożonych kariotypach często przestają się dzielić.
- Zrozumienie charakterystyki tych komórek może dostarczyć wiedzy na temat nowotworów i innych chorób.
- Izolacja tych komórek może ułatwić dalsze badania nad ich właściwościami.
Cel badania
- Opracowanie metody generowania i izolowania komórek z zatrzymanym cyklem komórkowym.
- Zbadanie charakterystyki komórek aneuploidalnych.
- Analiza interakcji pomiędzy komórkami aneuploidalnymi a układem odpornościowym.
Zastosowane metody
- Synchronizacja komórek RPE-1 hTERT z użyciem tymydyny i nocodazolu.
- Technika odrywania komórek (shake-off) w celu izolacji komórek mitotycznych.
- Analiza immunoblottingiem w celu oceny inhibitorów cyklu komórkowego.
- Barwienie na beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem w celu identyfikacji komórek ArCK.
Główne wyniki
- Komórki ArCK wykazują zwiększone poziomy inhibitorów cyklu komórkowego.
- Komórki te są pozytywne pod kątem markerów związanych ze starzeniem się.
- Wykresy segmentacyjne potwierdzają aneuploidię w wyizolowanych komórkach.
- Metoda ta skutecznie izoluje komórki o złożonych kariotypach.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodny sposób badania komórek aneuploidalnych.
- Wyizolowane komórki ArCK mogą być wykorzystywane do dalszych badań nad interakcjami immunologicznymi.
- Prawidłowe wykonanie metody pozwala na uzyskanie wyników w ciągu jednego tygodnia.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie komórek z zatrzymanym cyklem komórkowym i złożonymi kariotypami umożliwia mechaniczne ograniczenie ryzyka związanego z fenotypami napędzanymi przez aneuploidię w biologii odkrywczej. Podejście to wspomaga walidację celów terapeutycznych, zapewniając powtarzalny system do badania niestabilności chromosomowej oraz jej wpływu na starzenie się komórek, stan zapalny i oddziaływania immunologiczne. Opieranie tej metody na standardowych technikach hodowli tkanek zwiększa skalowalność i możliwość interdyscyplinarnego zastosowania w potokach badawczo-rozwojowych na wczesnym etapie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych wiążących aneuploidię z niestabilnością genomu i fenotypami prozapalnymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany, niskokosztowy schemat generowania komórek ArCK przy użyciu synchronizacji tymidyną, rewersyną i nocodazolem.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zdefiniowanej populacji komórek o złożonych kariotypach do ilościowej analizy markerów starzenia oraz sekrecji cytokin.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów poprzez spójną izolację komórek w stanie zahamowania cyklu za pomocą metody shake-off oraz zastosowania nocodazolu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań komórek aneuploidalnych z komórkami odpornościowymi, co dostarcza informacji niezbędnych do oceny celów immunomodulacyjnych.
- Wartość operacyjna: Pozwala na przeprowadzenie dalszych analiz funkcjonalnych, takich jak profilowanie cytokin oraz barwienie na beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem, w celu walidacji wyników fenotypowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od testowania hipotez dotyczących celów po przesiewy fenotypowe, w szczególności w odniesieniu do mechanizmów obejmujących niestabilność chromosomalną oraz szlaki odpowiedzi na stres.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację komórek o określonej złożoności kariotypowej w celu wyjaśnienia związków przyczynowo-skutkowych między aneuploidią a fenotypami komórkowymi.
- Screening: Umożliwia powtarzalne przygotowanie komórek ArCK do wysokoprzepustowej analizy inhibitorów cyklu komórkowego oraz profili wydzielniczych.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, w tym detekcji p53, p21, p16 za pomocą immunoblotingu oraz wykresów segmentacji dla zmienności liczby kopii w pojedynczych komórkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z badaniami nad interakcjami immunologicznymi, wspierając poszukiwanie biomarkerów w fenotypach wydzielniczych związanych ze starzeniem.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Wykorzystuje ogólnodostępne odczynniki i standardowy sprzęt do hodowli, co pozwala na adaptację w różnych laboratoriach bez konieczności posiadania specjalistycznej infrastruktury.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad aneuploidią, dostarczając zdefiniowanego modelu zatrzymania z kompleksowymi kariotypami.
- Wartość operacyjna: Zapewnia siedmiodniowy protokół o wysokiej specyficzności dla komórek ArCK, co zwiększa wydajność i powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go, umożliwiając wczesną ocenę ryzyk biologicznych napędzanych przez aneuploidię w docelowych szlakach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów powiązanych z niestabilnością chromosomową i starzeniem się komórek, skorygowaną o poziom ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach synchronizacji komórek oraz procedurach odrywania komórek mitotycznych (mitotic shake-off).
- Zależne od dostępu do standardowych inkubatorów do hodowli tkanek, hemocytometrów oraz mikroskopii fluorescencyjnej lub jasnopolowej w celu walidacji.
- Konieczna jest standaryzacja postępowania z nocodazolem oraz etapów płukania, aby zapewnić całkowite usunięcie komórek mitotycznych w powtórzeniach.
- Adaptacja do innych linii komórkowych może wymagać optymalizacji stężeń i czasu ekspozycji na tymydynę, rewersynę oraz nocodazole.
- Ograniczone do modeli in vitro; materiał źródłowy nie odnosi się do możliwości zastosowania w tkankach pierwotnych lub in vivo.
Często zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
