TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak to, w jakim stopniu modyfikacje chromatyczne są regulowane w sposób specyficzny dla typu komórki wraz z genomami. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy wyizolować chromatynę z docelowych komórek, a następnie podążać za typowym cygańskim strumieniem. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w specyficzny dla neuronów trimincil, lizyn 4, opisoncilly.

Może być również stosowany do innych modyfikacji histonów, innych typów komórek, a następnie innych organizmów modelowych. Procedurę zademonstruje Mari Mito, technik z mojego laboratorium. Na początek użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby rozciąć interesującą Cię tkankę na małe kawałki.

Dodaj fragmenty tkanek do czystego pojemnika wypełnionego ciekłym azotem. Następnie przenieś fragmenty tkanek do dwóch mililitrowych probówek wypełnionych ciekłym azotem. Przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez pięć minut z otwartą nakrętką, aby odparować ciekły azot.

Umieścić probówki zawierające próbki tkanek na schłodzonym metalowym stojaku na lód. Następnie umieść metalową kulę w 1,5-mililitrowej probówce i schłodź ją ciekłym azotem. Umieścić schłodzoną metalową kulę w jednej z probówek na próbki.

Zamknij nakrętkę i umieść rurkę w uchwycie probówki młynka kriogenicznego. Natychmiast zanurz zmontowany uchwyt probówki w ciekłym azocie na jedną minutę. Włóż uchwyt zamrożonej probówki do zewnętrznej kasety młynka kriogenicznego.

I potrząsaj nim energicznie przez 30 sekund, 60 razy. Następnie zdemontuj młynek kriogeniczny, usuń metalową kulę. Następnie umieść probówkę w wstępnie schłodzonej chłodziarce do pobierania próbek.

Przechowuj lodówkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie dodaj 900 mikrolitrów 1% formaldehydu do probówki i odpipetuj do wymieszania. Przenieś zawiesinę do nowej dwumililitrowej probówki z 900 mikrolitrami 1% formaldehydu.

Następnie utrwal zawiesinę na 10 minut, delikatnie obracając w temperaturze 23 stopni Celsjusza. Aby zatrzymać reakcję utrwalania, dodaj do probówki 100 mikrolitrów glicyny molowej o stężeniu 2,5 molowym. I wirować przy 3000 razy większej grawitacji przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć super supernatant. Dodaj jeden mililitr PBS do probówki i wiruj, aby wymieszać. Wirować w temperaturze 3000 razy większej niż grawitacja przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Powtórz ten krok prania jeszcze dwa razy. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy jeden do granulki i odpipetuj do wymieszania. Odwirować probówkę przez pięć minut przy trzykrotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant.

Dodaj jeden mililitr buforu do lizy, dwa do granulki i wiruj do wymieszania. Następnie odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 3000-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 800 mikrolitrów buforu do badania radioimmunoprecypitacji z koktajlem inhibitorów proteazy do osadu i pipety do wymieszania.

Odwirować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze 3000 razy większej niż grawitacja w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant. Następnie do granulatu dodaj 500 mikrolitrów buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie odwirować zawiesinę przez pięć minut przy 3000-krotności grawitacji w czterech stopniach Celsjusza i wyrzucić supernatant.

Dodaj jeden mililitr buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy. Natychmiast po dodaniu buforu RIPA z koktajlem inhibitorów proteazy, należy przenieść lizat do probówki sonikatora. I umieść rurkę na ultrasonografie.

Korzystając z ustawień opisanych w protokole tekstowym, ścinaj chromatynę. Następnie przenieś próbkę do 1,5-mililitrowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. I odwirowywać go przez pięć minut przy 20 000 razy większej grawitacji w czterech stopniach Celsjusza.

Pobrać supernatant z próbki i przenieść go do nowej probówki białkowej o niskim stopniu wiązania. W protokole tym wprowadzono i zademonstrowano sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny tandemowej. Podczas zabiegu jakość DNA była badana na wielu etapach.

Bezpośrednio po sonikacji ścięte DNA zostało wyizolowane i przetestowane za pomocą elektroforezy mikroprzepływowej. Po zastosowaniu przeciwciała anty-FLAG i przeciwciała anty-H3K3me3 do przeprowadzenia oczyszczania powinowactwa, jakość DNA została ponownie sprawdzona. Swoistość immunologicznego oczyszczania DNA na H2B-FLAG potwierdzono ujemnymi próbkami kontrolnymi.

Gdzie wykryto znikome ilości DNA. W dalszej części protokołu zweryfikowano jakość biblioteki sekwencjonowania. Skuteczność ChIP i T-ChIP została udowodniona poprzez analizę wzbogacenia przy użyciu starterów ukierunkowanych na region promotorowy genu GAPDH.

Uzyskano reprezentatywne redystrybucje wzdłuż trzech genów neuronów. Zaobserwowano wzbogacenie odczytów na pięciu pierwszych końcach genów przez neuron T-ChIP seek w całym mózgu. Po ustabilizowaniu się, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie epigenetyki do zbadania modyfikacji histonów specyficznych dla typu komórki ogólnie w neuronach u myszy.

Nie zapominaj, że praca z formaldehydem może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie gumowej odzieży i okularów.