Szybkie, bezproblemowe generowanie rekombinowanych pokswirusów przy użyciu zakresu gospodarzy i selekcji wizualnej

Nasza metoda wykorzystuje selekcję zakresu gospodarzy oraz markery fluorescencyjne do wydajnego i bezszwowego generowania rekombinowanego wirusa vaccinia w różnych typach komórek. Technika ta łączy szybkość rekombinacji homologicznej z bezbliznowym charakterem przejściowej selekcji dominantowej. Dodatkowo stosujemy selekcję zakresu gospodarzy, aby wyeliminować możliwość wystąpienia zmian indukowanych chemicznie. Metoda ta może być również wykorzystywana do modyfikacji wirusa vaccinia lub innych poxwirusów w celu ekspresji obcych genów, na przykład do wytwarzania szczepionek. W przypadku przeprowadzania tego protokołu wyłącznie z wykorzystaniem selekcji fluorescencyjnej należy upewnić się, że przesiewana jest wystarczająca liczba wirusów, aby wykryć stosunkowo rzadkie rekombinanty w warunkach braku presji selekcyjnej PKR. Metoda ta opiera się na nabywaniu i utracie markerów fluorescencyjnych w celu skutecznej selekcji wirusów, które pozyskały kasety rekombinacyjne, oraz wykrywania wirusów, które uległy bezbliznowej rekombinacji.

Aby wygenerować wektor rekombinacyjny, należy najpierw dodać do jednej probówki PCR na każdy amplikon 17 µL wody wolnej od DNaz, 1,2 µL każdego z primerów, 5 µL 5x buforu do reakcji PCR, matrycę DNA oraz 0,5 µL polimerazy DNA. Następnie należy dodać odpowiednią ilość wody wolnej od DNaz, aby osiągnąć objętość końcową 50 µL w każdej probówce, a następnie umieścić probówki w termocyklerze.

Denaturuj DNA w temperaturze 98 °C przez 30 s, a następnie przeprowadź 25 cykli trójetapowego protokołu PCR zgodnie z instrukcją. Aby zwizualizować produkty amplifikacji na 1% żelu agarozy, nanieś do każdego oczka 10 µL każdego produktu DNA oraz 2 µL buforu do nakładania próbek. Prowadź elektroforezę przez jedną godzinę przy napięciu 8 V/cm.

Po zakończeniu elektroforezy należy oczyścić każdy amplikon z żelu, stosując zestaw do ekstrakcji DNA z żelu zgodnie z protokołem producenta. Amplikony należy eluować z kolumny za pomocą 50 µl wody wolnej od DNaz, a następnie niezwłocznie odwirować. Aby zlinearyzować wektor klonujący, do probówki należy najpierw dodać 1 µg wektora, 17 µl wody wolnej od DNaz, 2 µl buforu reakcyjnego oraz 1 µl EcoRI i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Po zakończeniu inkubacji do każdego wyizolowanego amplikonu należy dodać 0,2 picomoli zlinearyzowanego wektora, 10 mikrolitrów wody wolnej od DNazy oraz 10 mikrolitrów master mixu do składania DNA. Próbki inkubowano w temperaturze 50 °C przez jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji przeprowadzono transformację chemicznie kompetentnych komórek E.coli przy użyciu dwóch mikrolitrów produktu składania zgodnie ze standardowymi protokołami.

Wysiej 100 µL transformowanych komórek na płytki z agaroza LB uzupełnioną o 100 µg/mL ampicyliny. Po inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C wybierz dobrze odizolowane kolonie w celu inokulacji w bulionie Luria uzupełnionym o 100 µg/mL ampicyliny, inkubując je przez noc w temperaturze 37 °C przy 225 obr./min.

Następnego ranka należy wykorzystać zestaw do minipreparatyki plazmidów w celu wyizolowania plazmidów, a następnie sprawdzić stężenie i czystość DNA za pomocą spektrofotometru.

W celu generowania rekombinowanego wirusa, zakaź konfluentną monowarstwę odpowiednich komórek w płytce sześciodołkowej wirusem przeznaczonym do rekombinacji przy wielokrotności zakażenia wynoszącej jeden. Zainkubuj zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji zastąp nadsącz w każdym dołku świeżą pożywką DMEM, a następnie, używając dostępnego komercyjnie odczynnika do transfekcji zgodnie z protokołem producenta, dodaj do każdego dołka 3 µg wybranego wektora rekombinacyjnego. Umieść płytkę w inkubatorze na kolejne 48 godzin, a następnie przenieś komórki z każdego warunku transfekcji do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml. Przeprowadź trzy cykle zamrażania i rozmrażania zgromadzonych komórek, a następnie poddaj otrzymane lizaty sonikacji przez 15 sekund przy amplitudzie 50%. Następnie wykonaj 10-krotne rozcieńczenia seryjne zsonikowanego lizatu w świeżej pożywce DMEM, od stężeń od 10¹ do 10⁶, i dodaj 1 ml każdego rozcieńczenia do oddzielnych konfluentnych dołków z linią komórkową kompetentną dla kinazy białkowej R. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na jedną godzinę, po czym zastąp nadsącze świeżą pożywką i ponownie umieść komórki w inkubatorze.

Po 24 do 48 godzin zidentyfikuj wirusy rekombinowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Plaque powstałe z wirusów rekombinowanych wykazują czerwoną fluorescencję dzięki integracji genu fuzyjnego mCherry-E3L. Przeprowadź trzykrotną puryfikację plackową wirusów rekombinowanych na komórkach RK13 typu dzikiego. Po trzech rundach puryfikacji plackowej zainfekuj komórki RK13+E3L+K3L seryjnymi rozcieńczeniami lizatu plackowego. Zidentyfikuj wirusy zapadnięte (collapsed viruses) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, używając odpowiedniego systemu obrazowania wyposażonego w kostki filtracyjne GFP i RFP. Następnie trzykrotnie przeprowadź puryfikację plackową zielonych placków VC-R4 lub bezbarwnych placków E3L na komórkach RK13+E3L+K3L. Upewnij się, że żadne placki nie wykazują czerwonej fluorescencji.

Zainfekuj komórki co najmniej 100 jednostkami tworzącymi plaki, aby zwiększyć szanse na zidentyfikowanie bezbarwnej plaki. W rzadkich przypadkach może być wymaganych kilka rund infekcji.

Czerwone fluorescencyjne plakietki w kompetentnych pod względem kinazy białkowej-R komórkach RK13 wskazują na wirusową ekspresję mCherry-E3L. Z kolei plakietki bezbarwne lub plakietki wykazujące jedynie ekspresję eGFP w komórkach RK13+E3L+K3L potwierdzają utratę markera selekcyjnego mCherry-E3L.

Rekombinowany wirus VC-R4, któremu brakuje obu antagonistów kinazy białkowej R, nie może replikować się w kompetentnych pod względem kinazy białkowej R komórkach RK13, podczas gdy wirus macierzysty vP872, który wykazuje ekspresję E3L, jest zdolny do replikacji. Aby potwierdzić, że brak zdolności do replikacji w komórkach RK13 wynikał wyłącznie z utraty E3L, w wirusie VC-R4 zastąpiono eGFP białkiem E3L, aby wygenerować odpowiedni wirus przy użyciu tego samego protokołu selekcji.

Co ciekawe, podczas tworzenia tego wirusa, przed selekcją w komórkach RK13+E3L+K3L, które są zazwyczaj wymagane do wyłonienia rekombinantów bez blizn, zidentyfikowano bezbarwne plaques zgodne z utratą markera selekcyjnego mCherry-E3L, co prawdopodobnie wynikało z rozległej identyczności sekwencji między kasetą rekombinacyjną mCherry-E3L a genem E3L wstawianym do VC-R4. Średnio 12,6% wirionów potomnych uległo rekombinacji z transfektowanym plazmidem, co jest zbliżone do wcześniej raportowanych częstotliwości.

Tutaj przedstawiono częstotliwość występowania bezbarwnych plam w stosunku do całkowitej liczby plam w komórkach RK13+E3L+K3L, co pokazuje, że tempo zapadania się i utrata markera selekcyjnego mCherry-E3L wystąpiły z częstotliwością około 1,8%.

W pierwszym etapie zastosowanie komórek kompetentnych względem PKR zapewnia, że wszystkie plaki będą zawierać wirusa rekombinowanego. W drugim etapie użycie komórek z niedoborem PKR umożliwia wykrycie wirusa rekombinowanego z zapadniętym locus mCherry-E3L.

Podejście to pozwala na szybkie generowanie wirusów zawierających geny egzogenne, na przykład w celu produkcji szczepionek lub ekspresji różnych wirusowych antagonistów PKR, co ułatwia analizę specyficznych dla gatunku interakcji z PKR pochodzącym od różnych gospodarzy.