Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnego Dendra2

Protokół ten pozwala na śledzenie i ilościowe określenie degradacji białka będącego przedmiotem zainteresowania u żywych i starzejących się C. elegans. Ta nieinwazyjna technika in vivo wymaga jedynie niewielkiej konfiguracji mikroskopowej, aby niezawodnie przekształcić Dendra2 w jasny i stabilny fluorofor. Metodę można dostosować do systemów ssaków, a także danio pręgowanego.

Aby badać, umieść obroty w sieci proteostatis, a także transport i handel. Należy uważać, aby nie sprowokować niepożądanej konwersji Dendra2 podczas skanowania laserem światła niebieskiego oraz przetestować i zoptymalizować ustawienia akwizycji i konwersji dla każdego systemu i białka fuzyjnego. Zacznij od wyhodowania nicieni w wieku dopasowanym do wieku 20 stopni Celsjusza do wieku pożądanego w eksperymencie.

W dniu eksperymentu obrazowego rozpuść agarozę ogólnego stopnia w stężeniu 3% w wodzie podwójnie destylowanej. Podczas gdy agaroza stygnie, odetnij końcówkę jednomililitrowej końcówki pipety, aby ułatwić aspirację około 400 mikrolitrów stopionej agarozy. Ostrożnie dodaj kilka kropli agarozy na czyste szkiełko podstawowe i natychmiast umieść kolejne szkiełko na wierzchu kropli, aby utworzyć cienką podkładkę agarozy między dwoma kawałkami szkła.

Gdy agaroza wyschnie, ostrożnie zdejmij górne szkiełko. Po przygotowaniu wystarczającej liczby szkiełek otwórz oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i ustaw ścieżkę światła dla wzbudzenia i emisji. Dla zielonej Dendry2 dodaj 486 do 553 nanometrów, a dla czerwonej Dendra2 dodaj 580 do 740 nanometrów.

Dostosuj moc i wzmocnienie obu kanałów zgodnie z intensywnością fluoroforu i ustaw otwór na pełne otwarcie. Wybierz sekwencyjny tryb kanału i ustaw ścieżkę tak, aby przełączała każdą klatkę. Ustaw tryb skanowania jako klatkę, a rozmiar klatki jako 1024 na 1024 z krokiem w linii równym jeden.

Ustaw uśrednienie na dwa i na średnią metodą i trybem linii jednokierunkowej. Ustaw głębię bitową na osiem bitów. Zdefiniuj ustawienie akwizycji wielowymiarowej dla konwersji Dendra2.

Do konwersji i wybielania użyj lasera diodowego o długości fali 405 nanometrów, ustawionego na 60% mocy energetycznej. Wybierz szereg czasowy składający się z dwóch cykli z odstępem 0,0 milisekundy między cyklami oraz normalnym początkiem i końcem. Ustaw wybielanie tak, aby rozpoczynało się po zeskanowaniu jednego z dwóch, powtarzało się przez 30 iteracji i kończyło się, gdy intensywność spadnie do 50%Następnie zdefiniuj szybkość zatrzymania piksela akwizycji na szybką w celu konwersji i na średnią w celu uchwycenia obrazu.

Aby zamontować nicienie na szkiełkach, użyj markera permanentnego, aby narysować i ponumerować okno z czterema kwadratami po przeciwnej stronie podkładki agarozowej na każdym szkiełku. Dodaj 15 mikrolitrów lewamizolu do środka podkładki agarozowej i użyj mikroskopu stereoskopowego i drucianego szpikulca, aby przenieść nicienie w tym samym wieku do kropelki. Użyj szpikulca do rzęs, aby delikatnie przesunąć każdą nicień do jednego okna kwadratu.

Kiedy wszystkie nicienie zostaną przemieszczone, poczekaj, aż robaki przestaną się poruszać, zanim umieścisz szkiełko nakrywkowe na płynie, aby unieruchomić nicienie podczas obrazowania. Następnie umieść szkiełko na stoliku mikroskopu konfokalnego. Aby uzyskać zieloną konwersję Dendra2, użyj okularu obiektywu 20 X pod wpływem zielonej fluorescencji, aby zlokalizować pierwszego nicienie i skupić się na głowie lub ogonie.

Przełącz się w tryb konfokalny i zwiększ lub zmniejsz wzmocnienie i moc lasera, aby uzyskać nasycony, ale nie prześwietlony obraz. Narysuj obszar zainteresowania wokół wybranego neuronu i narysuj drugi większy obszar zainteresowania wokół ogona, który zawiera pierwszy obszar zainteresowania. Ustaw pierwszy region, który ma zostać pobrany, wybielony i przeanalizowany.

Ustaw drugi obszar zainteresowania, który ma zostać pozyskany i przeanalizowany, ale nie wybielony. Ustaw prędkość skanowania na maksymalną i rozpocznij skanowanie, aby przekonwertować wybrane neurony Dendra2. Natychmiast po konwersji rozpocznij skanowanie na żywo za pomocą zielonego lasera o długości 561 nanometrów, aby zobrazować Dendra2 w czerwonym kanale i znaleźć ognisko i odpowiednią maksymalną projekcję przekształconego neuronu.

Szybko ustaw szybkość skanowania na niższą szybkość zatrzymywania pikseli i uzyskaj migawkę obrazu obu kanałów w wyższej rozdzielczości. Ten obraz jest traktowany w czasie zerowym po konwersji. Następnie zapisz skan z możliwą do zidentyfikowania nazwą i/lub numerem, a następnie etykietą czasu zerowego.

Aby śledzić degradację Dendra2 w czasie, otwórz obraz razy zero odpowiedniego neuronu nicienia. Korzystając z tego samego ustawienia obrazu, rozpocznij skanowanie na żywo w kanale czerwonym i ustaw ostrość na przekształcony czerwony neuron. Następnie, nie zmieniając żadnych parametrów akwizycji, uzyskaj migawkę z tą samą prędkością co pierwszy obraz.

Pamiętaj, aby dokładnie zdefiniować ustawienia konwersji, aby konwertować Dendra2 wydajnie i wystarczająco oraz utrzymywać te same parametry akwizycji w różnych punktach czasowych. Aby przeanalizować przekonwertowane obrazy Dendra2, otwórz obrazy czasu zerowego i drugiego punktu czasowego na Fidżi, a następnie otwórz Analizuj i ustaw pomiary. Wybierz funkcje Obszar i Zintegrowana gęstość, a następnie wybierz obraz uzyskany za pomocą kanału czerwonego.

Korzystając z narzędzia do zaznaczania wielokątów, narysuj obszar zainteresowania wokół czasu przekształcenia neuronu zerowego. Aby prawidłowo zidentyfikować kontury neuronu, wybierz Obraz, Dostosuj i Próg, aby podświetlić progi intensywności. Po zdefiniowaniu wyboru kliknij przycisk Analizuj i mierz.

Pojawi się wyskakujące okno wyników, w tym obszar, zintegrowane wartości gęstości i surowej zintegrowanej gęstości dla wybranego obszaru zainteresowania. Wykonaj ten sam proces selekcji i pomiaru dla obrazu od drugiego punktu czasowego. Następnie skopiuj wartości do arkusza kalkulacyjnego.

W tej reprezentatywnej analizie przed konwersją nie był widoczny żaden czerwony sygnał, gdy próbka była wzbudzona w kanale czerwonym. Po napromieniowaniu zielony sygnał słabł, gdy HTT-D2 był przekształcany, a następnie pojawiał się czerwony sygnał. Ekspresja HTT-D2 uległa degradacji z czasem, co spowodowało zmniejszenie poziomów czerwonego sygnału HTT-D2 i możliwy wzrost zielonego sygnału HTT-D2 w miarę syntezy większej ilości białka fuzyjnego.

Warto zauważyć, że neurony w okolicy ogona okazały się znacznie bardziej aktywne w porównaniu z neuronami głowy. Co więcej, nastąpiła znacznie większa degradacja kontroli HTTQ25-D2 24 godziny po konwersji, a następnie po dwóch godzinach zarówno w neuronach głowy, jak i ogona. Różnica ta nie została jednak zaobserwowana w patogennym HTTQ97-D2, co sugeruje, że sieć proteostazy nie była w stanie usunąć HTT-D2 zawierającego dłuższe odcinki glutaminy w całym układzie nerwowym.

HTTQ97-D2 nie uległ degradacji tak efektywnie jak HTTQ25-D2 u bardzo starych nicieni, co podkreśla niezdolność sieci proteostazy do usuwania zagregowanych i potencjalnie toksycznych gatunków huntingtyny u starszych zwierząt. Co ważne, neurony ogonowe były w stanie poradzić sobie z toksycznym HTTQ97-D2 u młodych nicieni, co sugeruje, że różne równoczesne mechanizmy sieci proteostazy mogą działać w celu usunięcia HTT-D2. Dla każdej próbki uzyskaj nieprześwietlony i nienasycony obraz natychmiast po konwersji i ponownie użyj tego samego ustawienia dla tej próbki przez cały czas.

Dzięki temu protokołowi możliwe jest testowanie zmian w sieci proteostatyki, a także, za pomocą mikroskopii superrozdzielczej, śledzenie rozprzestrzeniania się białek związanych z chorobą.