Izolacja kałowego (mikro) RNA
28 października 2020
Ten protokół izoluje wysokiej jakości całkowite RNA z próbek kału zwierząt i ludzi. Komercyjny zestaw do izolacji miRNA jest używany ze znaczną adaptacją do izolowania czystego RNA ze zoptymalizowaną ilością i jakością. Izolaty RNA są dobre dla większości dalszych testów RNA, takich jak sekwencjonowanie, mikromacierz i RT-PCR.
Przedstawiamy protokół izolacji RNA z próbek kału w celu badania mikroRNA. Protokół ten może być stosowany do izolowania RNA z kału o wysokiej jakości i ilości. Minimalizuje RNA z żywych drobnoustrojów.
Ważne jest, aby podkreślić, że bufor powiązania nie jest używany w tym protokole. Ten protokół jest prosty i nieskomplikowany. Zacznij od ponownego zaparcia od 25 do 100 miligramów próbek kału w 600 mikrolitrach sterylnego 1X DPBS w dwumililitrowej probówce wirówkowej.
Inkubować probówkę zawierającą próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie rozgnieć mieszaninę za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety i dobrze zwirować. Zawiesić mieszaninę w homogenizatorze z ustawieniem na jeden cykl z prędkością 4 000 obrotów na minutę przez 45 sekund, aby zoptymalizować i zwiększyć ilość i jakość RNA.
Dodać 600 mikrolitrów kwaśnego roztworu chloroformu fenolowego do próbki i wirować mieszaninę przez 60 sekund. Alternatywnie, aby zoptymalizować zwiększoną ilość RNA w plonie, wymieszaj go z homogenizatorem. Odwirować próbkę przez 15 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej i organicznej.
Powtarzaj wirowanie, aż interfejs będzie zwarty. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną, nie naruszając dolnej fazy, do nowej dwumililitrowej probówki wirówkowej z nasadką zawiasową. Dodaj 100% etanol klasy ACS o stężeniu 1,25 x objętość nabytej fazy wodnej i wiruj przez trzy sekundy.
Umieść wkład filtra w rurkach zbiorczych. Załaduj 600 mikrolitrów każdej z próbek do wkładu filtracyjnego dostarczonego w zestawie do izolacji mikroRNA. Wirować przy 10 000 x g przez 90 sekund, aby przefiltrować mieszaninę przez wkład.
Następnie wyrzucić filtrat. Powtarzaj tę czynność, aż cała objętość mieszaniny zostanie przefiltrowana przez tę samą membranę filtracyjną w kolejnych aplikacjach. Po wszystkim próbka jest filtrowana.
dodać 700 mikrolitrów roztworu płuczącego mikroRNA 1 do tego samego wkładu filtrującego. Wirować przez 60 sekund, aby przefiltrować roztwór płuczący przez wkład filtra. Wyrzucić filtrat i umieścić wkład filtra na tej samej probówce zbiorczej.
Umyj wkład filtra 700 mikrolitrami roztworu płuczącego 2/3 przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS i odwiruj przy 10 000 x g przez minutę. Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce. Umyj wkład filtra 500 mikrolitrami roztworu płuczącego 2/3 i odwiruj przy 10 000 x g przez minutę.
Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej. Umyć wkład filtra 250 mikrolitrami roztworu myjącego 2/3 przygotowanego ze 100% etanolu klasy ACS i odwirować przy 10 000 x g przez minutę. Wyrzuć uzyskany filtrat i umieść wkład filtra w tej samej probówce zbiorczej.
Na koniec przenieś wkład filtra do nowej rurki zbiorczej i obracaj zespołem przez pięć minut, aby usunąć pozostały płyn. Przenieś wkład filtra do nowej probówki zbiorczej, a następnie dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz do środka filtra i zakryj rurkę. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
Następnie obracaj probówkę przez pięć minut w temperaturze 8 000 x g, aby odzyskać RNA do nowej probówki zbiorczej. Test elektroforezy RNA oparty na chipach sugeruje, że reprezentatywne izolaty RNA z kału myszy i człowieka mają niską zawartość lub brak kompozycji rRNA 18S i 28S, a rozmiar izolatów RNA mieści się w małym regionie RNA. Dalsza elektroforeza małego RNA z elektroforezą opartą na chipie ujawniła, że duża część RNA ma rozmiar mikroRNA.
Czystość wyekstrahowanego RNA była wysoka, na co wskazuje współczynnik absorbancji wynoszący 2,0 dla długości fal 260 i 280 nanometrów oraz wartość współczynnika 1,8 dla absorbancji przy 260 i 230 nanometrach. Aby zapewnić powodzenie ekstrakcji organicznej, upewnij się, że powierzchnie są oczywiste i przenoszą tylko górną fazę wodną bez zakłócania dolnej fazy, nawet kosztem zmniejszonej objętości naszej fazy wodnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia prostą metodę izolacji wysokiej jakości RNA z próbek kału, minimalizującą zanieczyszczenia pochodzące od żywych drobnoustrojów. Metoda ta jest przeznaczona zarówno dla zwierząt, jak i ludzi, zapewniając zoptymalizowaną wydajność i czystość dla dalszych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrobiologia
- Biologia molekularna
Wstęp
- Izolacja RNA z próbek kału jest kluczowa dla badania miRNA.
- Tradycyjne metody mogą prowadzić do zanieczyszczenia RNA mikrobiologicznego.
- Wysoka jakość RNA jest niezbędna do dokładnych analiz w dalszych etapach badań.
- Niniejszy protokół adaptuje komercyjny zestaw do izolacji miRNA w celu uzyskania lepszych wyników.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody ekstrakcji RNA z kału.
- Poprawa jakości i ilości izolowanych RNA.
- Ułatwienie badań nad mikroRNA w różnych kontekstach biologicznych.
Zastosowane metody
- Resuspensja próbek kału w sterylnym 1X DPBS.
- Użycie probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml do obróbki próbek.
- Adaptacja komercyjnego zestawu do izolacji miRNA.
- Minimalizacja kontaminacji RNA pochodzącego z żywych drobnoustrojów.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja wysokiej jakości całkowitego RNA z próbek kału.
- Zoptymalizowany protokół pozwala na uzyskanie RNA odpowiedniego do sekwencjonowania i RT-PCR.
- Wykazana skuteczność w redukcji zanieczyszczeń mikrobiologicznego RNA.
- Protokół jest prosty i przejrzysty dla badaczy.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia niezawodną metodę ekstrakcji RNA z próbek kału.
- Wysoka jakość RNA jest kluczowa dla dalszych zastosowań analitycznych.
- Modyfikacje komercyjnych zestawów mogą zwiększyć wydajność i czystość uzyskanego RNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja wysokiej czystości RNA z próbek kału umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w walidacji celów terapeutycznych, zapewniając dostęp do mikroRNA pochodzenia gospodarza bez zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Wspiera to pewność prognostyczną w odkrywaniu biomarkerów i analizie szlaków sygnałowych w chorobach żołądkowo-jelitowych i systemowych. Skalowalność i odtwarzalność protokołu ułatwiają jego ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach w ramach procesów odkrywania leków oraz badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie sygnatur mikroRNA gospodarza w kale w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych i wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez minimalizację sygnałów zakłócających pochodzących z żywych drobnoustrojów podczas przygotowania próbki.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie izolatów RNA odpowiednich do sekwencjonowania, RT-PCR oraz zastosowań w mikromacierzach, co umożliwia wiarygodne odczyty podczas screeningu związków.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowane etapy płukania i rozdziału faz zapewniają powtarzalność i skalowalność w rozwoju testów wysokoprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych poprzez uzyskiwanie profilów małych RNA istotnych dla przebiegu choroby z modeli kalowych zwierzęcych i ludzkich.
- Wartość operacyjna: Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki spójnej jakości i ilości RNA.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnego etapu odkrywania (Early Discovery) po identyfikację związku wiodącego (Lead Identification) i walidację przedkliniczną, zapewniając zestandaryzowany materiał wejściowy dla analiz omicznych oraz testów funkcjonalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację RNA pochodzenia gospodarza ze złożonych matryc kałowych.
- Screening: Umożliwia przygotowanie testów dzięki uzyskaniu wysokiej wydajności i czystości RNA, kompatybilnych z analitycznymi platformami następczymi.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary RNA o wysokiej czystości (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8), co pozwala na dokładne porównanie warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zastosowaniu niezależnemu od gatunku w modelach mysich i ludzkich.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalną możliwość izolacji RNA z kału w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Większa pewność predykcyjna dzięki ograniczeniu zanieczyszczeń mikrobiologicznych i ulepszonej walidacji celu w badaniach nad interakcjami gospodarz-mikrobiom.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zoptymalizowanym etapom resuspensji, przemywania i filtracji.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach w programach opartych na biomarkerach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, w oparciu o wiarygodne dane pochodne z RNA.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z kwasami nukleinowymi oraz technikach separacji fazowej, aby uniknąć zaburzeń w warstwie interfazy.
- Konieczne jest zastosowanie wirówki zdolnej do osiągnięcia 10,000 x g oraz homogenizatora z prędkością 4,000 rpm do przetwarzania próbek.
- Wymagana jest standaryzacja limitów masy próbki (25–200 mg) w obrębie zespołu w celu zapewnienia spójnego odzysku fazy wodnej.
- Kwestie adaptacji obejmują dostosowanie objętości płukania oraz czasów inkubacji w zależności od rodzaju próbek i ilości inhibitorów.
- Ograniczenie praktyczne: próbki przekraczające 200 mg mogą pogorszyć separację faz i czystość RNA ze względu na niestabilność interfazy.
