Przygotowanie warstw nośnych próbek w transmisyjnej mikroskopii elektronowej przy użyciu bloku flotacyjnego
8 kwietnia 2021
Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jest znaczącym wąskim gardłem w procesie określania struktury tej metody. W tym miejscu podajemy szczegółowe metody wykorzystania łatwego w użyciu, drukowanego trójwymiarowo bloku do przygotowania folii nośnych do stabilizacji próbek do transmisyjnych badań EM.
W tym miejscu przedstawiamy ulepszone protokoły przygotowania próbek krio-EM z foliami nośnymi przy użyciu nowatorskiego bloku flotacyjnego, który ułatwia obsługę tak delikatnych folii. Kluczową zaletą tej metody jest to, że próbka jest chroniona przed powierzchnią styku powietrze-woda, gdzie mogą wystąpić szkodliwe skutki, takie jak denaturacja. Jeden z przedstawionych tutaj protokołów pozwala uniknąć wszelkiego rodzaju kosztownych zabiegów, które czynią wykresy hydrofilowymi, zwiększając w ten sposób ich dostępność dla całej społeczności EM.
Małe urządzenia flotacyjne nie są jeszcze powszechnie stosowane w elektromikroskopii w celu dobrego przygotowania. Tak więc te wizualne demonstracje mogą stanowić punkt odniesienia dla ich użycia. Na początek umyj kratki TEM podwójnie destylowaną wodą i octanem ethelu, a następnie wyczyść plazmą.
Następnie dodać 10 do 12 mikrolitrów próbki do studzienki wymiany buforowej, bloku flotacyjnego i 10 do 12 mikrolitrów 2% roztworu octanu pisuaru do sąsiedniej studzienki wymiany bez buforu w celu barwienia ujemnego. Konieczne jest podjęcie odpowiednich środków ostrożności podczas pracy z plamą. Ostrożnie pokrój dwa małe kawałki miki z wstępnie osadzoną folią węglową na wierzchu.
Upewnij się, że fragmenty miki są wystarczająco szerokie, aby zmieścić się w studzience i dłuższe niż długość studzienki, tak aby fragment mógł siedzieć na studni, podczas gdy węgiel unosi się na wodzie i było wystarczająco dużo miejsca, aby poradzić sobie z fragmentem za pomocą pęsety. Zanurz mikę w studzience pod przybliżonym kątem 45 stopni, aż mika usiądzie na rampie studni, a warstwa węgla będzie obserwowana na powierzchni próbki cieczy. Po inkubacji węgla z próbką, należy bardzo powoli wycofać arkusz miki, aby odzyskać warstwę węglową i zminimalizować zatrzymywanie resztkowej próbki lepkości.
Ostrożnie osusz mikę, stukając w dolną powierzchnię niewęglową bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar płynu i zanurz fragment miki w przeciwległej studzience zawierającej 2% roztwór octanu pisuaru, aby wymienić warstwę węgla na ujemne zabarwienie. Odzyskaj pływającą warstwę węgla za pomocą świętej strony pokrytej węglem umytej i oczyszczonej plazmowo siatki EM. Następnie pozostaw siatki do wyschnięcia na powietrzu do czasu obrazowania na TEM, najlepiej zakrywając je, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
Po oczyszczeniu siatek TEM, jak pokazano wcześniej, należy przygotować zawiesinę tlenku grafenu tuż przed użyciem i dokładnie przemieszać. Następnie dodaj od 10 do 12 mikrolitrów zawiesiny tlenku grafenu do czterech studzienek wymiany bez bufora. wzdłuż bloku flotacyjnego.
Dodaj 10 do 12 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody lub ultraczystej wody do pozostałych czterech studzienek wymiany buforowej bloku. Delikatnie upuść cztery siatki na zawiesinę tlenku grafenu w każdym dołku i inkubuj przez jedną minutę, aby upewnić się, że święta strona pokryta węglem styka się z roztworem. Po jednej minucie ostrożnie odzyskaj każdą siatkę, wsuwając pęsetę w rowek pęsety w każdej studzience wymiany bez bufora.
Delikatnie i krótko popchnij miedzianą, niepokrytą węglem stronę każdej kratki podwójnie destylowaną wodą w sąsiedniej studni, aż kropla wody będzie widoczna na siatce. Następnie ostrożnie przytrzymaj kroplę wody z siatki do góry nogami na kawałku bibuły filtracyjnej. Przykryj kratki i pozostaw je w pęsetzie do wyschnięcia na powietrzu.
Umieść cztery siatki myjące na miedzianym arkuszu graficznym osadzonym na szklanym szkiełku i przykryj każdą siatkę kroplą izopropanolu, aby umożliwić bliski kontakt między jednowarstwowym grafenem a siatką. Po całkowitym odparowaniu izopropanolu należy spławić arkusz grafenu miedzianego z kratkami na roztworze chlorku żelaza w szklanej szalce Petriego. Następnie przykryj naczynie, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza i pozostaw je na noc do wytrawienia w temperaturze pokojowej.
Użyj pętli o średnicy większej niż rozmiar siatki TEM, aby wyłowić siatki unoszące się na monowarstwie grafenu i ostrożnie przenieś je na szklaną szalkę Petriego zawierającą podwójnie destylowaną wodę do mycia. Umyć kratki dwukrotnie w wodzie i przenieść kratki na szalkę Petriego zawierającą bufor do próbek do czasu przygotowania próbki i zamrożenia wgłębnego. Dodać 10 do 12 mikrolitrów próbki do studzienki bloku flotacyjnego.
Gdy próbka jest gotowa w bloku, należy pobrać siatkę pokrytą grafenem z roztworu buforowego za pomocą czystej pęsety i umieścić ją na powierzchni studzienki zawierającej próbkę. Po odpowiednim okresie inkubacji podnieś siatkę za pomocą czystej pęsety do zamrażania i przystąp do osuszania i witryfikacji. Siatki barwione ujemnie przygotowane za pomocą wsporczego bloku flotacyjnego są zwykle pokryte węglem amorficznym na całej powierzchni siatki.
Chociaż w niektórych przypadkach dochodzi do pęknięcia filmu węglowego, duża liczba kwadratów siatki jest nieskazitelna i dlatego nadaje się do barwienia negatywowego. Podobnie, dobre pokrycie folią jest rutynowo osiągane w całej sieci przy użyciu protokołu tlenku grafenu. Siatki z tlenku grafenu można szybko przygotować z surowców i zapewniają one wysoką ochronę próbki.
Utrzymywanie grafenu w stanie mokrym i nałożenie próbki na miejscu tuż przed zamrożeniem jest wystarczające do wytworzenia odpowiednich warstw lodu dla cryo-EM. Protokół ten nie wymaga sprzętu do uczynienia grafenu hydrofilowym i zapewnia przewagę w odzyskiwaniu próbek. Blok flotacyjny nośny ma dwa porty igłowe w miejscu każdej studzienki, które umożliwiają rozszerzanie bufora w C2, co jest bardzo przydatne w przypadku próbek pochodzących z gradientów glicerolu.
Blok flotacyjny umożliwił zbadanie metod oczyszczania powinowactwa do sieci poprzez wykorzystanie kontrolowanego przepływu o małych objętościach, a także funkcjonalizowanych folii nośnych.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono ulepszone protokoły przygotowania próbek do krio-mikroskopii elektronowej (cryo-EM) z wykorzystaniem nowatorskiego bloku flotacyjnego do manipulowania delikatnymi błonami wsporczymi, takimi jak węgiel amorficzny, grafen i tlenek grafenu. Blok flotacyjny usprawnia przenoszenie i nanoszenie błon wsporczych, minimalizując ręczną manipulację, ograniczając zanieczyszczenia i chroniąc próbki przed szkodliwym wpływem granicy faz powietrze-woda. Przedstawiono szczegółowe procedury przygotowania i nanoszenia tych podłoży, co zwiększa integralność próbek oraz ułatwia prowadzenie badań EM.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM)
- Biologia strukturalna
- Techniki przygotowania próbek
Wstęp
- Wyznaczanie struktur metodą Cryo-EM rozwija się gwałtownie, jednak przygotowanie próbek wciąż stanowi wąskie gardło procesu.
- Próbki makromolekularne najlepiej obrazować w lodzie witryfikowanym, lecz wiele z nich jest wrażliwych na graniczny obszar powietrze-woda, co prowadzi do ich denaturacji.
- Folie wspierające (węgiel amorficzny, grafen, tlenek grafenu) mogą chronić próbki, ale ich obsługa bez ryzyka uszkodzenia lub zanieczyszczenia jest trudna.
- Istniejące metody często wymagają czasochłonnego płukania, czyszczenia lub kosztownych zabiegów w celu nadania podłożom właściwości hydrofilowych.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie protokołów przygotowania próbek do krio-EM z foliami wspierającymi przy użyciu intuicyjnego bloku do flotacji.
- Zminimalizowanie ręcznego przenoszenia i zanieczyszczeń podczas transferu folii wspierającej.
- Zapewnienie przystępnych metod, które nie wymagają kosztownych zabiegów hydrofilowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i czyszczenie siatek TEM przy użyciu wody destylowanej, octanu etylu oraz czyszczenia plazmowego.
- Nakładanie błon wspierających (węglowych, grafenowych, tlenku grafenu) na siatki przy użyciu bloku flotacyjnego.
- Krokowe przenoszenie błon metodą flotacji na mokro, minimalizujące ekspozycję na powietrze i zanieczyszczenia.
- Protokoły barwienia negatywowego i witryfikacji w celu konserwacji i obrazowania próbek.
Główne wyniki
- Blok flotacyjny umożliwia wydajny i powtarzalny transfer folii wspierających przy minimalnym ryzyku ich przerwania.
- Folie z węgla amorficznego i tlenku grafenu zapewniają dobre pokrycie i chronią próbki przed interfejsem powietrze-woda.
- Siatki z tlenku grafenu można szybko przygotować z surowców, co eliminuje konieczność stosowania obróbki hydrofilowej.
- Blok flotacyjny umożliwia wymianę buforu oraz oczyszczanie powinowactwa bezpośrednio na siatce, co zwiększa jego użyteczność.
Wnioski
- Blok flotacyjny upraszcza przygotowywanie siatek do cryo-EM z foliami wspierającymi, ograniczając liczbę kroków manualnych oraz ryzyko kontaminacji.
- Protokoły są dostępne i nie wymagają specjalistycznego sprzętu do obróbki hydrofilowej.
- Podejście to poprawia integralność próbek i rozszerza możliwości zastosowania folii wspierających w badaniach cryo-EM.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne i powtarzalne przygotowanie próbek do krio-EM jest kluczowe dla procesów biologii strukturalnej, jednak ze względu na kruchość próbek i ryzyko zanieczyszczeń wciąż stanowi ono wąskie gardło. Blok do flotacji nośników umożliwia usprawniony transfer delikatnych folii nośnych, ograniczając manualną manipulację i zachowując integralność próbki dla obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Innowacja ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych etapach odkryć i wspiera stabilny rozwój portfolio poprzez minimalizację artefaktów oraz strat materiału.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia wiarygodną analizę struktury makromolekularnej poprzez ochronę próbek przed denaturacją na granicy faz powietrze-woda.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez zachowanie natywnych konformacji podczas przygotowywania siatek.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną dzięki minimalizacji uszkodzeń i kontaminacji próbek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych siatek EM do późniejszych etapów przepływów pracy w badaniach strukturalnych.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację nakładania folii wspierającej w różnych partiach.
- Umożliwia szybkie i skalowalne przygotowanie siatek z nośnikami z amorficznego węgla, grafenu lub tlenku grafenu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zachowuje integralność próbek w badaniach translacyjnych wymagających wysokiej wierności danych strukturalnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając niezawodne obrazowanie trudnych próbek.
- Minimalizuje ryzyko wyników fałszywie ujemnych wynikających z denaturacji lub kontaminacji próbek.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda bloku flotacyjnego jest integrowana na etapie przygotowania próbek, łącząc wczesne odkrywanie i identyfikację związków wiodących z przepływami pracy w obrazowaniu przedklinicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie pozyskiwania wysokiej jakości danych strukturalnych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, zminimalizowane pod kątem zanieczyszczeń siatki do wiarygodnej oceny związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki obrazowania o wysokiej integralności do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność próbek dla późniejszych badań nad biomarkerami lub mechanizmami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zstandaryzowany, wielokrotnego użytku protokół, który można dostosować do różnych folii podpierających i rodzajów próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność strukturalną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przepływy pracy, ogranicza liczbę kroków manualnych i minimalizuje ryzyko kontaminacji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go poprzez poprawę jakości i powtarzalności danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez ograniczenie utraty próbek i błędów w przygotowaniu.
Kwestie implementacyjne
- Wymaga doświadczenia w obsłudze siatek EM oraz transferze folii nośnej.
- Wymagany dostęp do bloku flotacyjnego, urządzenia do czyszczenia plazmowego oraz standardowej infrastruktury do przygotowania próbek EM.
- Wymagana standaryzacja międzyzespołowa w celu uzyskania powtarzalnych wyników w różnych projektach.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do nośników węglowych, grafenowych oraz tlenku grafenu, co zostało wykazane w pracy.
- Potencjalne ograniczenia obejmują sporadyczne pękanie folii oraz konieczność rygorystycznej kontroli zanieczyszczeń.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Negatively Stained Samples with Amorphous Carbon Support
2:21
Preparation of Graphene Oxide-coated TEM Grids
3:27
Preparation of Samples on Monolayer-graphene Films Using the Flotation Block
4:44
Results: Examples of Sample Support Films Prepared Using the Floatation Block
5:34
Conclusion
