Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej
20 listopada 2021
Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.
Z biegiem lat monowarstwy lipidowe były stosowane jako warstwa nośna wspomagająca krystalizację 2D białek błony obwodowej, a także białek rozpuszczalnych. Metoda ta może być również stosowana do krystalizacji 2D, jako niektórych integralnych białek błonowych. Wymaga jednak bardziej rozległych badań empirycznych w celu określenia warunków detergentu i dializy, które sprzyjają podziałowi na monowarstwę lipidową.
Na granicy faz powietrze-woda tworzy się monowarstwa lipidowa, tak że polarne grupy główne lipidu pozostają uwodnione w fazie wodnej. I niepolarne ogony acylowe przegrody lipidowej do granicy faz powietrze-woda, które łamią napięcie powierzchniowe i spłaszczają powierzchnię wody. Charakter ładunku, charakterystyczne ugrupowania chemiczne grup głów lipidowych, zapewniają powinowactwo do białek w roztworze.
Promowanie wiązania, a w zasadzie tworzenia tablic 2D. Wszelkie kryształy 2D utworzone na monowarstwie lipidowej można łatwo przenieść do mikroskopu elektronowego na pokrytej węglem siatce EM, która służy do podnoszenia i podtrzymywania krystalicznej matrycy na warstwie lipidowej. Opisaliśmy w tym manuskrypcie metodologię monowarstwowej warstwy lipidowej do obrazowania w kriogenicznej mikroskopii elektronowej.
Preparat jednowarstwowy lipidów. Preparat podstawowy lipidów, przygotować mieszaninę lipidów w proporcji 0,01 mg na ml w stosunku 9:1 objętościowo do objętości chloroformu, metanolu. Używając 8,91 ml chloroformu i 0,99 ml metanolu oraz 0,1 ml 10 mg na ml roztworu lipidów.
Przygotowanie płytki teflonowej. Sonikować płytkę teflonową w kąpieli metanolowej przez pięć minut. Myć gorącą wodą przez 15 minut, a następnie spłukać wodą destylowaną.
Wysuszyć płytkę teflonową w wysuszonym miejscu przez 30 minut i przechowywać ją w próżni do momentu użycia. Tworzenie monowarstwy lipidowej na zbiorniku buforowym. Szacowany czas pracy wyniesie półtorej godziny.
Umieść bibułę filtracyjną typu pierwszego na szalce Petriego i ułóż blok teflonu na bibule filtracyjnej. Napełnij studzienki płyty teflonowej 60 mikrolitrami buforu. Ostrożnie dodawaj płynną mieszaninę na wierzch powierzchni bufora kropla po kropli.
Najlepiej jeden mikrolitr na kroplę za pomocą strzykawki Hamiltona. Zwilż bibułę filtracyjną wodą destylowaną i utrzymuj wilgotność na szalce Petriego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut, chloroform powinien odparować i powinna powstać monowarstwa lipidu na powierzchni.
Zastosowanie siatki EM na monowarstwie lipidowej. Szacowany czas pracy to półtorej godziny. Delikatnie umieść siatkę EM pokrytą węglem bez żarzenia, wyładowując węgiel stroną do dołu na powierzchnię każdego zbiornika buforowego.
Ostrożnie wstrzyknąć białka do dołka iniekcji bocznej, użyć końcowych stężeń białka w studzience wokół jednego mikromola. Inkubować 60 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wstrzyknąć około 20 do 30 mikrolitrów buforu do portu iniekcyjnego w miejscu, aby podnieść siatkę ponad powierzchnię bloku teflonowego.
Pozwala to podnieść siatkę za pomocą pęsety i podnieść ją pionowo z kropli. Reprezentatywne wyniki. Monowarstwę lipidową osadzoną na siatce EM można uwidocznić pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym bez barwienia kontrastowego.
Obecność monowarstwy można rozpoznać po różnicy kontrastu w stosunku do obszaru, w którym nie ma żadnej próbki na tej ścieżce wiązki. Obszary, które mają pokrycie monowarstwą lipidową, mają niższy kontrast niż te bez pokrycia. Ponieważ wiązka elektronów przez puste otwory nie ulega rozproszeniu, pokazuje jaśniejsze oświetlenie.
Podsumowując, metoda monowarstwy lipidowej daje możliwość badania struktur białkowych ze względu na swoją prostotę. Może stanowić alternatywne podejście ułatwiające proces krystalizacji 2D.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Monowarstwy lipidowe stanowią stabilną podstawę dla dwuwymiarowej krystalizacji białek, co ułatwia badania strukturalne. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w przypadku peryferyjnych białek błonowych oraz białek rozpuszczalnych, a po odpowiedniej optymalizacji może zostać również zastosowana do białek integralnych błon.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Biologia strukturalna
- Biochemia
Wstęp
- Monowarstwy lipidowe tworzą się na granicy fazy powietrze-woda.
- Polarne grupy głowowe pozostają nawodnione w fazie wodnej.
- Niepolarne ogony acylowe rozmieszczają się na granicy fazy powietrze-woda.
- Chemiczny charakter grup głowowych lipidów wpływa na powinowactwo białek.
Cel badania
- Przedstawienie metody przygotowywania monowarstw lipidowych.
- Wsparcie krystalizacji różnych białek.
- Usprawnienie badań strukturalnych poprzez zastosowanie lepszych technik obrazowania.
Zastosowane metody
- Przygotowanie monowarstw lipidowych na granicy faz powietrze-woda.
- Optymalizacja warunków dializy i zastosowania detergentów.
- Empiryczne badanie rozdziału białek.
- Techniki obrazowania elektronowego do analizy strukturalnej.
Główne wyniki
- Monowarstwy lipidowe skutecznie wspomagają krystalizację białek.
- Specyficzne warunki zwiększają powinowactwo białek do monowarstwy.
- Białka integralne błon mogą zostać poddane krystalizacji po dodatkowej optymalizacji.
- Metoda ta zapewnia stabilną platformę do obrazowania elektronowego.
Wnioski
- Monowarstwy lipidowe stanowią wszechstronne narzędzie w biologii strukturalnej.
- Umożliwiają one badanie zarówno peryferyjnych, jak i integralnych białek błonowych.
- Konieczne są dalsze badania w celu doprecyzowania warunków pozwalających na uzyskanie optymalnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metody monowarstw lipidowych umożliwiają kontrolowaną dwuwymiarową krystalizację białek, co wspiera wyznaczanie struktury celów błonowych i rozpuszczalnych. Podejście to usprawnia walidację celów poprzez zapewnienie powtarzalnych platform do charakterystyki biofizycznej, redukując niepewność we wczesnych etapach odkrywania leków. Technika ta ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki uzyskiwaniu strukturalnych informacji o wysokiej rozdzielczości, co wspomaga optymalizację związków wiodących oraz decyzje dotyczące portfela projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie oddziaływań białko-lipid oraz stanów konformacyjnych istotnych dla funkcji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany system oceny stabilności celu i zdolności do wiązania.
- Wartość naukowa: Wspiera funkcjonalną walidację celu, umożliwiając analizę strukturalną w warunkach zbliżonych do natywnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie jednorodnych, uporządkowanych macierzy białkowych odpowiednich do zastosowań w przesiewaniu o wysokiej rozdzielczości.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność przygotowania próbek, co jest kluczowe dla spójności testów w różnych zespołach.
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników strukturalnych, które umożliwiają korelację z danymi z testów funkcjonalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza informacji strukturalnych na temat białek błonowych będących celami terapeutycznymi, pomagając w zrozumieniu mechanizmów chorób.
- Wartość operacyjna: Pozwala na przygotowanie transferowalnych preparatów kompatybilnych z późniejszymi etapami analizy cryo-EM.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie cech strukturalnych z aktywnością farmakologiczną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda monowarstwy lipidowej integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, wspierając walidację celu i identyfikację związków wiodących poprzez charakterystykę strukturalną.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez poprzez wizualizację strukturalną rozmieszczenia i oddziaływań białek.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie do analizy poprzez wytwarzanie jednorodnych kryształów 2D, zapewniających spójność pomiarów biofizycznych.
- Analityka: Dostarcza dane obrazowe o wysokiej rozdzielczości, które pozwalają zespołom porównywać stany strukturalne w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia strukturalne z ciągłością przedkliniczną poprzez wyjaśnianie mechanizmów działania celów terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do przesiewania strukturalnego dla wielu celów białkowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez bezpośrednią obserwację strukturalną.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację przygotowywania próbek do badań strukturalnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) poprzez zmniejszenie niepewności strukturalnej przy wyborze celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o zwalidowane dane strukturalne i funkcjonalne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie manipulacji lipidami, oczyszczania białek oraz nauki o powierzchniach międzyfazowych.
- Zależy od dostępu do sprzętu kompatybilnego z pomieszczeniami typu cleanroom, takiego jak strzykawki Hamiltona i podłoża teflonowe.
- Wymaga standaryzacji warunków buforowych i czasów inkubacji pomiędzy laboratoriami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych klas białek, w szczególności do białek błon integralnych.
- Jest ograniczona potrzebą empirycznej optymalizacji detergentów oraz warunków dializy dla niektórych celów badawczych.
