Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami
10 sierpnia 2021
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.
Zastosowanie AAA-ATPaz do usuwania białek z dwuwarstwy lipidowej jest częstym tematem w kontroli jakości białek. Mechanistyczne zrozumienie tego istotnego procesu wymaga zrekonstruowanego systemu. Wcześniejsze rekonstytucje za pomocą AAA-ATPaz były złożone i niejednorodne.
Nasz system jest prosty i w pełni zdefiniowany. To pozwala nam manipulować AAA-ATPazą Msp1, substratem i środowiskiem lipidowym. Na początek dodaj wcześniej przygotowany bufor do rozpuszczenia, oczyszczone białka Msp1 i TA oraz liposomy w probówce PCR, a następnie inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut.
Podczas inkubacji przyciąć końcówkę końcówki pipety P200 do średnicy około 1/8 cala. Następnie dokładnie zmieszaj probówkę zawierającą BioBeads, aby uzyskać jednolitą mieszankę. Następnie szybko zdejmij pokrywkę i za pomocą przeciętej końcówki pipety P200 przenieś odpowiednią objętość kulek do pustej probówki PCR.
Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji w celu rozpuszczenia, za pomocą nieodciętej końcówki pipety, usuń cały płyn z BioBeads. Następnie przenieś 100 mikrolitrów rozpuszczonej substancji do probówki z BioBeads i pozwól jej obracać się na kole przez 16 godzin. Następnego dnia odwiruj probówkę w PicoFuge, aby granulować kulki, a następnie przenieś odtworzony materiał do czystej probówki do PCR i trzymaj probówkę na lodzie.
W celu usunięcia białek, które nie uległy rekonstytucji w liposomach, należy zrównoważyć kolumny wirowe glutationu buforem ekstrakcyjnym, co zwykle obejmuje trzy rundy przemywania 400 mikrolitrami buforu, a następnie odwirowanie w celu usunięcia buforu. Następnie dodaj pięć mikromoli każdego białka opiekuńczego do odtworzonego materiału, a następnie 100 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego, zwiększając objętość do 200 mikrolitrów. Dodaj tę mieszaninę do zrównoważonych kolumn wirujących glutationu, a następnie zatkaj kolumny wirujące i obracaj je przez 30 minut, pozwalając opiekuńczym związać się z żywicą.
Po obróceniu krótko obróć kolumny. Zebrać przepływ, który jest wstępnie oczyszczonym materiałem pozbawionym zagregowanych białek. Umieść go na lodzie i bezpośrednio przejdź do testu ekstrakcji.
Przygotuj probówki do analizy SDS-PAGE. Dodaj 45 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do rurki wejściowej, 40 mikrolitrów wody do rurki przepływowej i 16,6 mikrolitrów bufora ładującego 4X SDS-PAGE do każdej probówki. Do testu ekstrakcji należy przygotować reakcję ekstrakcji i zwiększyć końcową objętość do 200 mikrolitrów za pomocą buforu ekstrakcyjnego.
Następnie podgrzej test ekstrakcyjny w bloku grzewczym o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Aby rozpocząć test, dodaj ATP do końcowego stężenia dwóch milimoli. Obracaj probówkę przez pięć sekund w PicoFuge i inkubuj ją w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Podczas inkubacji należy pobrać pięciomikrolitrową próbkę reakcji i dodać ją do probówki wejściowej. Należy również zrównoważyć jedną kolumnę wirową glutationu dla każdej próbki w teście ekstrakcji, jak wykazano wcześniej. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji dodaj 200 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do probówki, zwiększając całkowitą objętość do 400 mikrolitrów.
Następnie dodaj tę reakcję do zrównoważonej żywicy glutationowej i pozwól jej obracać się przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po obróceniu obróć kolumny, aby zebrać przepływ, a następnie pobierz 10-mikrolitrową próbkę do rurki przepływowej. Przemyć żywicę dwukrotnie 400 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego, odrzucając przepływ po każdym płukaniu.
Po trzecim praniu utrzymuj przepływ i pobierz próbkę o pojemności 50 mikrolitrów do rurki myjącej. Następnie przygotuj pięć mililitrów buforu elucyjnego, dodając zredukowany glutation do końcowego stężenia pięciu milimoli w buforze ekstrakcyjnym. Dodać 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do kolumny wirowej i inkubować przez pięć minut.
Następnie odwirować kolumnę i zebrać przepływ. Powtórz etap elucji jeszcze raz. Po drugiej elucji pobrać 50-mikrolitrową porcję z próbki elucji i dodać ją do probówki elucyjnej.
Po uruchomieniu western blot wydajność ekstrakcji można określić, porównując ilość substratu we frakcji eluowanej z frakcją wejściową. Sygnał w przepływie wykazuje pewną zmienność, ale jest na ogół podobny do frakcji wejściowej, a we frakcji płuczącej nie ma sygnału. Zazwyczaj skuteczność ekstrakcji wynosi około 10% w przypadku kontroli dodatniej i od 1 do 2% skuteczności ekstrakcji w przypadku kontroli ujemnej.
Gdy warunki rekonstytucji nie są zoptymalizowane, poziomy ekstrakcji są porównywalne między próbkami dodatnimi i ujemnymi. Technika ta pozwoliła naszemu laboratorium przetestować właściwości biofizyczne substratu wpływającego na rozpoznawanie przez Msp1.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcyjnej Msp1 z wykorzystaniem w pełni oczyszczonych komponentów w zdefiniowanych proteoliposomach. Celem badania jest uproszczenie procesu rekonstytucji AAA-ATPaz, które odgrywają kluczową rolę w kontroli jakości białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia komórki
Wstęp
- AAA-ATPazy odgrywają kluczową rolę w usuwaniu białek z dwuwarstw lipidowych.
- Zrozumienie mechanizmu tego procesu wymaga zastosowania układu zrekonstytuowanego.
- Poprzednie metody były złożone i niejednorodne.
- Niniejsze badanie przedstawia prosty i w pełni zdefiniowany układ rekonstrukcyjny.
Cel badania
- W celu manipulacji AAA-ATPase Msp1 oraz jego substratem.
- W celu stworzenia określonego środowiska lipidowego do badania.
- W celu pogłębienia zrozumienia mechanizmów ekstrakcji białek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie buforu do rekonstytucji.
- Zastosowanie oczyszczonych białek Msp1 i TA.
- Wprowadzenie liposomów do probówki PCR.
- Inkubacja mieszaniny na lodzie przez 10 minut.
Główne wyniki
- Opracowano prosty i skuteczny protokół rekonstrukcji białka Msp1.
- Zdefiniowany układ pozwala na lepszą manipulację komponentami.
- Uzyskano pogłębione zrozumienie procesu ekstrakcji.
- Wyniki wskazują na poprawę wydajności kontroli jakości białek.
Wnioski
- Badanie dostarcza prostą metodę badania AAA-ATPaz.
- Przyczynia się ono do zrozumienia procesu ekstrakcji białek z błon.
- Niniejszy protokół może zostać zastosowany w dalszych badaniach nad kontrolą jakości białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia mechaniczną redukcję ryzyka w procesie ekstrakcji białek pośredniczonej przez AAA-ATPase, która jest konserwatywną ścieżką kontroli jakości istotną dla proteostazy mitochondrialnej. Dzięki zastosowaniu w pełni zdefiniowanego, zrekonstytuowanego układu z oczyszczonymi komponentami, protokół ten wspiera walidację celów oraz opracowywanie testów w chorobach związanych z dysfunkcją mitochondriów, w tym w procesach neurodegeneracji i nowotworach. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez izolację zmiennych wpływających na rozpoznawanie substratu i wydajność ekstrakcji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie roli białka Msp1 w usuwaniu błędnie zlokalizowanych białek zakotwiczonych na C-końcu (TA), co wspiera funkcjonalną walidację celów w szlakach proteostazy mitochondrialnej.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje oczyszczone białko Msp1, białka TA oraz liposomy w celu wyeliminowania złożoności komórkowej, co pozwala na precyzyjną manipulację aktywnością ATPase, substratem oraz środowiskiem lipidowym.
- Wartość predykcyjna: Ułatwia analizę zależności struktura-funkcja w procesie rozpoznawania substratu przez Msp1, pomagając w identyfikacji wiodących związków będących modulatorami aktywności ekstrakcji białek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ustanawia ilościowy test ekstrakcji, w którym wydajność jest mierzona poprzez porównanie poziomów substratu w eluate względem materiału wejściowego za pomocą metody Western blot.
- Wartość operacyjna: Definiuje ustandaryzowane warunki: 10-minutową inkubację na lodzie w celu rekonstytucji, 16-godzinną rotację z BioBeads oraz 30-minutową ekstrakcję napędzaną przez ATP w temperaturze 30°C, a następnie elucję glutationem.
- Gotowość testu: Wyniki obejmują wydajność ekstrakcji (zazwyczaj ~10% dla kontroli pozytywnej, 1–2% dla negatywnej), co umożliwia wykrywanie trafień oraz przesiewy zależne od dawki w formacie rekonstytuowanym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Łączy mechanizmy proteostazy mitochondrialnej z modelami chorób, w których dysfunkcja Msp1 jest powiązana z nowotworami, starzeniem się i neurodegeneracją.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Izoluje zmienne wpływające na ekstrakcję — takie jak skład lipidowy i biofizyka substratu — aby wyjaśnić oddziaływanie na cel i zmniejszyć niejednoznaczność w przedklinicznej walidacji celu.
- Ciągłość: Wspiera przejście od biochemicznej walidacji celu do przesiewu fenotypowego w systemach relewantnych dla danej choroby poprzez zdefiniowanie minimalnego, kontrolowanego modułu ekstrakcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces wczesnego etapu odkrywania leków, umożliwiając walidację celu poprzez mechaniczną analizę ekstrakcji białek, co dostarcza informacji niezbędnych do opracowania testów dla kaskad przesiewowych i wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o stopień zaangażowania celu oraz modulację szlaku.
- Biologia odkryć: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących wpływu środowiska lipidowego i cech substratu na aktywność ATPase Msp1 oraz wydajność ekstrakcji.
- Przesiewanie: Zapewnia zrekonstytuowaną, ilościową platformę do oceny wpływu związków na ekstrakcję napędzaną przez ATPase, z określonymi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi.
- Analityka: Generuje mierzalne wyniki – wydajność ekstrakcji określaną poprzez porównanie frakcji eluatu i wejściowej za pomocą Western blot – umożliwiając statystyczne porównanie różnych warunków.
- Badania translacyjne: Odnosi się do znaczenia przedklinicznego poprzez modelowanie konserwatywnej ścieżki kontroli jakości, której zaburzenia są powiązane z chorobami ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zdefiniowany system zrekonstytuowany w liposomach pozwala na ponowne wykorzystanie w projektach badających AAA-ATPazy, specyficzność substratową lub zależną od lipidów modulację ekstrakcji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach ekstrakcji białek dzięki zastosowaniu uproszczonego, zdefiniowanego systemu.
- Wartość operacyjna: Poprawia odtwarzalność i standaryzację dzięki zastosowaniu oczyszczonych komponentów oraz etapowego protokołu (rekonstytucja, traktowanie BioBead, wstępne oczyszczanie chaperonów, ekstrakcja zależna od ATP, elucja glutationem).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji badań (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnej oceny potencjału modulacji celu przed przeprowadzeniem testów komórkowych lub fenotypowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w kontroli jakości mitochondriów z uwzględnieniem ryzyka, wyjaśniając odpowiedzialność mechanistyczną i podatność celu na modyfikacje.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w oczyszczaniu białek, rekonstytucji liposomów oraz projektowaniu analiz aktywności ATPase.
- Zależy od dostępu do ultrawirówki lub PicoFuge do wirowania osadu, kolumn spinowych z glutationem oraz bloków grzejnych z kontrolą temperatury.
- Wymaga standaryzacji składu lipidów, stosunku białka do polipidów oraz stężenia ATP pomiędzy laboratoriami w celu zapewnienia powtarzalnej wydajności ekstrakcji.
- Adaptacja do innych białek TA lub AAA-ATPase może wymagać optymalizacji buforu do rekonstytucji, czasu inkubacji oraz etapów delipidacji lipidów przy użyciu kulek.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność sygnału w części przepływowej oraz zależność od czułości Western blot w przypadku substratów o niskiej zawartości, jak zaznaczono w źródle.
