Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Ogólnym celem tej procedury jest wbudowanie transportera ABC, w tym przypadku transportera maltozy malfGK2, w rozpuszczalne nanocząsteczki dyskowe błony (nanodiski). Osiąga się to poprzez wstępne zmieszanie białka rusztowania błony MSP z transporterem i odpowiednią ilością lipidów w micelach detergentu.

Drugim krokiem jest dodanie kulek polistyrenowych i delikatne mieszanie zawiesiny przez noc; detergent jest stopniowo absorbowany przez kulki, co umożliwia formowanie się nanocząsteczek dysków. Następnie kulki usuwa się poprzez sedymentację. Ostatnim krokiem jest oddzielenie prawidłowo uformowanych dysków od agregatów i niezespołowanych białek rusztowaniowych za pomocą chromatografii żelowej.

Na koniec jakość dysków ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy w żelu lub spektroskopii rozpraszania światła. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak liposomy, jest fakt, że białka błonowe i dyski są całkowicie rozpuszczalne w roztworach wodnych. Dodatkowo domeny białkowe są teraz dostępne z obu stron.

Ponieważ obecnie nie ma już przedziału membranowego, dzięki zastosowaniu białek rusztowania membranowego o różnych długościach, udało mi się uwięzić i zbadać różne stany wiązań białek błonowych. Co najważniejsze, metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki błonowej, takie jak identyfikacja nowych partnerów wiążących transporterów a, b, C. W rzeczywistości zastosowania tej techniki wykraczają dalej w stronę terapii, ponieważ może ona pomóc w odkrywaniu aktywatorów lub inhibitorów białek błonowych i receptorów.

Choć metoda ta wydaje się prosta, należy zachować ostrożność przy wyborze odpowiedniego stosunku białek do lipidów. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mają trudności z obliczeniem właściwego stosunku molarnego lub przeprowadzeniem odpowiedniej kontroli zapewniającej jakość preparatu. Dlatego też wizualna demonstracja tej metody jest bardzo przydatna dla studenta chcącego poznać poszczególne etapy oraz potencjalne trudności.

Aby rozpocząć, należy hodować MSP z dodatkiem sześciokrotnego znacznika histydynowego w szczepie e coli BL 21 DE3 z plazmidu P MSSP 1D1. Indukcję produkcji białka przeprowadza się, gdy zmierzona gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosi około 0,5, i kontynuuje przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 5 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad resuspenduje się w buforze TSG 10 zawierającym 100 µM PMSF. Komórki należy poddać lizie w prasie francuskiej trzykrotnie przy 8 000 PSI. Materiał nierozpuszczalny usuwa się przez wirowanie przy 5 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie frakcję rozpuszczalną zawierającą MSP izoluje się poprzez ultrawirowanie przy 125 000 ×g przez 45 minut.

Oczyść MSP za pomocą chromatografii z chelatorami niklu, wykorzystując około 1,5 ml żywicy nickel seros high performance w buforze TSG 10. Wypłucz zanieczyszczenia buforem TSG 10 zawierającym 50 mM imidazolu. Eluuj MSP buforem TSG 10 zawierającym 600 mM imidazolu po przeprowadzeniu dializy.

Oczyszczone białko w buforze TSG 10 MSP można przechowywać w temperaturze -70 °C przy stężeniu białka wynoszącym około 10 do 15 mg/mL. Kompleks MALF GK 2, z tagiem His na C-końcu MAL K, jest ekspresowany z plazmidu PED 22 FG K w szczepie E. coli BL 21 DE 3; produkcję białka indukuje się, gdy zmierzona gęstość optyczna przy 600 nm wynosi około 0,5, stosując 0,2% L-arabinozy przez trzy godziny w temperaturze 37 °C, a następnie przeprowadza się lizę komórek i wirowanie.

Podobnie jak poprzednio, osad błonowy resusppendownujemy w buforze TSG 20 do końcowego stężenia 5 mg/mL. Następnie materiał solubilizujemy za pomocą 1% (m/v) GDM przez trzy godziny w temperaturze 4 °C przy delikatnym wytrząsaniu. Materiał nierozpuszczalny usuwamy poprzez ultrawirowanie, analogicznie do procesu oczyszczania MAL FTK two.

Następnie należy zebrać nadsącz zawierający zsolubilizowany kompleks mal FTK two i ponownie go oczyścić za pomocą chromatografii z chelatorami niklu. Dalsze oczyszczanie kompleksu przeprowadza się metodą chromatografii żelowej w buforze TSGD na kolumnie SUEx 200, HR ten trzy hundred przy szybkości przepływu 0,5 milliliters per minute. Aby przygotować fosfolipidy, całkowity ekstrakt lipidowy z e coli rozpuszczony w chloroformie rozdziela się na 1000 anomal aliquots w probówkach typu microfiche z nakrętką; rozpuszczalnik odparowuje się pod delikatnym strumieniem azotu, a następnie suszy przez noc w próżni.

Następnie wysuszyć, rozpuścić błonę lipidową w buforze TS przy końcowym stężeniu NMO wynoszącym 5 i energicznie wymieszać w wiertleksie, a następnie poddać sonikacji impulsowej pięć razy przez około pięć sekund. Rozpuszczone lipidy będą wydawać się lekko mętne ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, lecz powinny pozostać w zawiesinie. Dodać DDM do końcowego stężenia 0,5%. W tym momencie roztwór stanie się klarowny; umieścić mieszaninę lipidów w łaźni wodnej i poddać sonikacji impulsowej pięć razy przez około pięć sekund.

Mieszaninę lipidową można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie jeden tydzień. Aby przygotować bio-beads, należy umieścić około 10 do 15 ml bio-beads w probówce o pojemności 50 ml. Następnie należy przemyć kuleczki 50 ml 100% metanolu.

Pozostaw kuleczki do opadnięcia pod wpływem grawitacji, a następnie ostrożnie odlej roztwór. Powtórz ten proces raz dla metanolu, następnie dwukrotnie dla 95% etanolu, wody Milli-Q, a na koniec dla buforu TS. Rozpocznij konstytuowanie nano-dyskretne poprzez rozcieńczenie MSP w buforze TSGD do końcowego stężenia wynoszącego około 7 mg/mL lub 0,3 mM.

Aby zapewnić sukces eksperymentu, ważne jest wybranie odpowiednich proporcji lipidów i białek do zmieszania. Wymieszać około 2 µM oczyszczonego kompleksu malf GK dwa w stosunku białka do MS P i lipidów wynoszącym 1:3:60 w buforze TSGD, aby uzyskać objętość końcową 300 µL. Tutaj przygotowano również próbkę z nadmiarem lipidów w stosunku 1:3:400 jako kontrolę negatywną. Dodać do probówki 50 µL zawiesiny bio-beads i inkubować mieszaninę przez noc na stole kołyszącym w temperaturze 4 °C. Następnego dnia odwirować kuleczki grawitacyjnie. Po osadzeniu się kuleczek pobrać roztwór za pomocą wąskiej końcówki, aby uniknąć pobrania jak największej liczby bio-beads.

Usuń duże osady poprzez ultrawirowanie przy 100 000 xg przez 20 minut. Następnie przeprowadź oczyszczanie dysków za pomocą chromatografii żelowej, zgodnie z wcześniejszą procedurą, w buforze TSG 10. W dalszej kolejności wprowadź Eloqua na tę samą kolumnę do chromatografii żelowej, aby przetestować stabilność preparatu.

Następnie połącz frakcje zawierające nanodyski. Jakość preparatu ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy w żelu. Przeanalizuj jeden mikromol nanodysków, aby ocenić jakość rekonstytucji.

Należy również ocenić wiązanie mal E z kompleksem mal ftk two zrekonstytuowanym w nanodyskach. Po elektroforezie żel należy barwić błękitem Coomassie przez 10 minut, a następnie odbarwiać przez około jedną godzinę. Aby przeprowadzić dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), najpierw należy oczyścić nanodyski za pomocą chromatografii filtracyjnej, jak wcześniej, używając kolumny Superdex 200 10/300 przy szybkości przepływu 0,1 ml/min.

Połączyć frakcje zawierające nanodyski i zagęścić do stężenia około 10 mg/ml za pomocą wirówki z filtrem AmCon. Następnie przefiltrować próbkę dwukrotnie. Przeprowadzić analizę metodą DLS przy użyciu urządzenia dynapro nano star w kwarcowej kuwecie o objętości wewnętrznej 1 µl.

Wykorzystując oprogramowanie dynamiczne do oszacowania średnicy i masy cząsteczkowej cząsteczek, określ aktywność ATPase dla dwóch zrekonstytuowanych nanodysków mal FTK za pomocą testu kolorymetrycznego. Najpierw zmieszaj 1 µM oczyszczonych dysków oraz 1 mM ATP z rosnącymi ilościami mal e. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 20 minut.

Następnie zmierz uwalnianie fosforanu nieorganicznego przy 660 nanometrach. Porównaj ilość uwolnionego fosforanu z krzywą wzorcową wyznaczoną za pomocą roztworu wzorcowego fosforu. Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii filtracyjnej żelowej.

Chromatogram pokazuje, że większość zrekonstytuowanych dysków eluuje jako pojedynczy pik, podczas gdy dyski przygotowane z nadmiarem lipidów eluują w objętości martwej oraz jako seria szerokich pików; jakość preparacji dysków analizowano dodatkowo za pomocą natywnej elektroforezy w żelu. Dyski zrekonstytuowane z ograniczoną ilością lipidów migrują jako wąski prążek na żelu natywnym, natomiast te zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów migrują jako rozmazy. Analiza metodą DLS wykazuje, że populacja dysków jest jednorodna ze średnim promieniem 5,0 nanometrów. Na podstawie przybliżenia DLS zrekonstytuowane dyski mają pozorną masę cząsteczkową 215 kilodaltonów; próbki zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów wykazują szeroki rozkład promieni wokół 100 nanometrów, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.

Aktywność kompleksu MAL FTK 2 ocenia się poprzez pomiar szybkości hydrolizy TP oraz powinowactwa do partnerów oddziaływania, takich jak białko wiążące maltozę, MAL E. MAL E wiąże się z wysokim powinowactwem do transportera MAL FTK 2 w metodzie nieodtwarzającej elektroforezy żelowej. Możliwe jest wykrycie kompleksu między MAL E a MAL FTK 2; tutaj przedstawiono stymulację aktywności MAL KA TPA przez MAL E jako funkcję stężenia MAL E.

Tworzenie nanodysków jest stosunkowo proste, jednak niewielkie odchylenia od optymalnych warunków mogą prowadzić do nieodwracalnej agregacji białek; po opanowaniu ta technika może zostać zrealizowana w mniej niż dwa dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o kluczowej roli wyboru odpowiedniego stosunku białka do lipidów, ponieważ nadmiar lipidów doprowadzi do powstania dużych, polidyspersyjnych cząstek przypominających liposomy. Jest niezwykle istotne, aby dokładnie analizować jakość zrekonstytuowanego materiału, stosując techniki inne niż filtracja żelowa, takie jak spektroskopia rozpraszania światła, analityczna ultrawirówka lub w prostszy sposób elektroforeza w żelu w warunkach natywnych.

Należy pamiętać, że rodzaj fosfolipidu wbudowanego w dysk, a także rodzaj białka rusztowania błony mogą wpływać na wydajność rekonstytucji. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zdobyli Państwo rzetelną wiedzę na temat tego, jak generować rozpuszczalne i homogeniczne nanodyski zawierające wybrany przez Państwa białka błonowe. Życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.