Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50
12 lutego 2022
Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.
Celem tego protokołu jest uzyskanie miareczkowania zapasu wirusa i jego wizualizacja za pomocą barwienia fioletem krystalicznym. W tym celu zostanie zademonstrowane ogólne miareczkowanie wirusa, a następnie barwienie. Miareczkowanie to będzie przeprowadzane na 96-dołkowej płytce przez okres siedmiu dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
Aby to zrobić, 96-dołkowa płytka preferowanej linii komórkowej zostanie wysiana przy użyciu odpowiedniego podłoża i pozostawiona do wzrostu aż do zlewania się. Zapas wirusa zostanie rozcieńczony przy użyciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przez zmieszanie 900 mikrolitrów pożywki i 100 mikrolitrów wirusa lub odpowiednie rozcieńczenie. Upewnij się, że każda probówka jest wirowana, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki i wirusa oraz uniknąć błędów w rozcieńczeniach.
W leadzie napisz układ swojej płytki, a także każde rozcieńczenie, aby pomóc podczas procesu infekcji. Przed infekcją przemyć 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 50 mikrolitrów swojego inokulum do odpowiednich studzienek.
Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez siedem dni. Po siedmiodniowej inkubacji przemyć 200 mikrolitrami PBS. Utrwal komórki, dodając 50 mikrolitrów PFA na studzienkę o stężeniu 4% w PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji ponownie umyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS przed dodaniem 50 mikrolitrów fioletu krystalicznego na studzienkę w wodzie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec odessać fiolet krystaliczny ze studzienek i opcjonalnie pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej lub umyć je 200 mikrolitrami wody, aby usunąć nadmierną plamę przed wizualizacją. W rezultacie, po ponownym zabarwieniu, ujemne komórki zostaną wybarwione.
Dodatnie studnie zostaną wyczyszczone. Informacje te zostaną wykorzystane w jednej z dwóch opisanych formuł do obliczenia ostatecznego miana wirusa. Kiedy porównano miano uzyskane za pomocą każdej metody, okazało się, że w monocytochemii barwienie może w niektórych przypadkach wykryć dodatkowe dołki dodatnie w porównaniu z fioletem krystalicznym, i że podobnie obie metody barwienia mogą wykryć więcej dodatnich dołków niż ocena wizualna za pomocą mikroskopii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia dokładną metodę wizualizacji miana wirusów z wykorzystaniem barwienia fioletem krystalicznym. Metoda ta została porównana z mikroskopią optyczną oraz barwieniem immunocytochemicznym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Biologia komórki
- Techniki laboratoryjne
Wprowadzenie
- Miareczkowanie wirusa jest niezbędne do ilościowego określenia zapasów wirusa.
- Barwienie fioletem krystalicznym pozwala na wizualną ocenę obecności wirusa.
- Metody porównawcze obejmują mikroskopię optyczną oraz barwienie immunocytochemiczne.
- Prawidłowe techniki rozcieńczania są kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- W celu wykonania miareczkowania zapasu wirusa.
- W celu wizualizacji miareczkowania za pomocą barwienia fioletem krystalicznym.
- W celu zapewnienia dokładności metod ilościowego oznaczania wirusa.
Zastosowane metody
- Wysiewanie wybranej linii komórkowej na płytkę 96-dołkową.
- Przygotowanie dziesięciokrotnych rozcieńczeń zapasu wirusa.
- Mieszanie każdego rozcieńczenia w wortexie w celu zapewnienia jednorodności.
- Barwienie fioletem krystalicznym po siedmiodniowym okresie inkubacji.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja miana wirusów z wykorzystaniem fioletu krystalicznego.
- Porównanie z innymi metodami barwienia wykazało spójność wyników.
- Osiągnięto dokładną kwantyfikację zapasów wirusów.
- Protokół stanowi niezawodną metodę dla przyszłych badań.
Wnioski
- Barwienie fioletem krystalicznym jest skuteczną metodą wizualizacji miana wirusa.
- Protokół ten zwiększa dokładność ilościowego oznaczania wirusów.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej metodzie w różnych zastosowaniach.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne miareczkowanie wirusów jest kluczowe dla przesiewowego badania leków przeciwwirusowych oraz opracowywania szczepionek, gdzie niespójna detekcja efektu cytopatycznego (CPE) może zagrażać identyfikacji związków wiodących oraz decyzjom o kontynuacji lub przerwaniu badań. Barwienie fioletem krystalicznym stanowi kostuktywną i powtarzalną alternatywę dla barwienia immunocytochemicznego, co poprawia standaryzację testów i zmniejsza zmienność w początkowych etapach procesów odkrywania leków. Wspiera to pewność prognostyczną w ocenie skuteczności przeciwwirusowej i umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe przesiewy w oparciu o TCID50 dla wirusów wywołujących efekt cytopatyczny.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia obiektywną kwantyfikację zakaźności wirusa, ograniczając zależność od subiektywnej analizy mikroskopowej i wspierając mechanistyczną weryfikację ryzyka dla celów przeciwwirusowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybką i niskokosztową metodę barwienia, która zwiększa przepustowość testów oraz powtarzalność w walidacji trafień przeciwwirusowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje jasne, mierzalne punkty końcowe dla testów TCID50, poprawiając stosunek sygnału do szumu w kampaniach przesiewowych związków.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania kosztownych odczynników ICC, obniżając koszt pojedynczego testu i umożliwiając szersze zastosowanie w platformach odkrywania leków przeciwwirusowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia spójne pomiary miana wirusa w różnych badaniach, co wspiera wiarygodne modelowanie zależności dawka-odpowiedź w przedklinicznych badaniach skuteczności.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację przygotowania zapasów wirusa pomiędzy laboratoriami, redukując zmienność międzyeksperymentalną w badaniach umożliwiających złożenie wniosku o IND.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków przeciwwirusowych, od wczesnego potwierdzania trafień (hit confirmation) po optymalizację liderów (lead optimization), w którym dokładne miareczkowanie wirusa dostarcza informacji na temat zależności struktura-aktywność oraz profilu oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez zapewnienie powtarzalnych modeli zakażeń wirusowych na potrzeby badań nad mechanizmem działania.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, mierzalnych wyników niezbędnych do przejścia z etapu identyfikacji związków aktywnych do etapu optymalizacji w kaskadach przesiewania leków przeciwwirusowych.
- Analityka: Umożliwia precyzyjne obliczanie wartości TCID50, co pozwala na dokładne porównanie potencji związków w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przejścia z przeciwwirusowego przesiewania in vitro do modeli zakażeń in vivo dzięki spójnej kwantyfikacji zapasów wirusa.
- Zastosowania w skali przedsiębiorstwa: Stanowi skalowalne, niskokosztowe rozwiązanie możliwe do zastosowania w odniesieniu do wielu celów wirusowych i obszarów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną dotyczącą skuteczności przeciwwirusowej poprzez ograniczenie liczby wyników fałszywie ujemnych wynikających z wizualnej oceny CPE.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność testów TCID50 dzięki uproszczonemu, zestandaryzowanemu barwieniu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową programów przeciwwirusowych poprzez obniżenie kosztów analizy bez utraty jakości danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o kontynuowaniu prac w oparciu o ocenę ryzyka, dostarczając wiarygodnych danych o mianie wirusa dla kryteriów go/no-go.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest podstawowe przeszkolenie z zakresu wirusologii oraz stosowanie technik aseptycznych w celu bezpiecznego obchodzenia się z wirusami w środowiskach BSL-2.
- Metoda opiera się na standardowym wyposażeniu laboratoryjnym, w tym inkubatorach, wirówkach i czytnikach płytek do opcjonalnej kwantyfikacji.
- Niezbędne jest uzgodnienie między zespołami czasu trwania barwienia oraz protokołów płukania, aby zapewnić powtarzalność międzylaboratoryjną.
- Metoda ma zastosowanie do adherentnych linii komórkowych wspierających powstawanie CPE; optymalizacja może być wymagana w przypadku wirusów nieadherentnych lub niewywołujących CPE.
- Metoda jest ograniczona do wirusów wywołujących wykrywalny efekt cytopatyczny; nie nadaje się do modeli infekcji niecytopatycznych lub trwałych bez wprowadzenia modyfikacji.
