Kwantyfikacja ruchliwości roju powierzchni bakterii na płytkach gradientu induktora

Protokół jednocześnie śledzi reakcje roju bakterii na różne stężenia induktora na półstałym agarze . Osiąga się to w sposób opłacalny. Ta wysokoprzepustowa technika przesiewowa neguje potrzebę stosowania agaru o różnych stężeniach induktora w celu obserwacji odpowiedzi mikrochemotaktycznych.

Technika ta jest przeznaczona do badań przesiewowych leków, a także do obserwacji odpowiedzi SD mikropatogenów. Może być również używany do badania mikroreakcji na różne sygnały biochemiczne w ludzkim gospodarzu. Ta metoda może zapewnić wgląd w chemotaksję bakteryjną.

Bakterie będą reagować na różne stężenia atraktantów chemicznych znanych jako pozytywna chemotaksja lub repelenty chemiczne znane jako ujemna chemotaksja. Starannie przygotowana konfiguracja jest niezbędna, aby uniknąć różnic między kątem żelu dolnej warstwy, aby zapobiec problemowi z odtwarzalnością. Na początek oznacz szalki Petriego o wymiarach 13 na 13 centymetrów kwadratowych plamami i nazwami induktorów.

Następnie podeprzyj naczynia nad krawędzią pokrywek. Dodaj roztwór arabinozy do ciepłej dolnej warstwy podłoża. Dodaj 40 mililitrów ciepłej pożywki z dolnej warstwy.

Pozwól pożywce dolnej warstwy utwardzić się bez przykrycia przez godzinę w okapie z przepływem laminarnym bez zakłóceń. Gdy dolna warstwa całkowicie zastygnie, zdejmij pokrywki i umieść szalki Petriego w okapie z przepływem laminarnym. Dodaj 40 mililitrów ciepłej pożywki z górnej warstwy za pomocą zmotoryzowanego filtra pipetowego.

Utwardź dwuwarstwowe płytki przykryte i nienaruszone przez godzinę, a następnie przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Umieść oznaczony papier A4 pod dobrze zastygłą płytą gradientową. Wsuń szerszą stronę końcówki pipety o pojemności 100 mikrolitrów w półstałą powierzchnię podłoża w zaznaczonym miejscu i dociśnij końcówkę pipety, aż dotrze do dolnej części górnej warstwy podłoża.

Gdy końcówka dotknie dna, przestań przykładać jakąkolwiek siłę pionową do końcówki i delikatnie obróć końcówkę, aby odizolować zawartość cylindrycznej studzienki. Przesuń poziomo końcówkę pipety na niewielką odległość, aby umożliwić przepływ powietrza do wąskiego miejsca odłożonego na bok. Naciśnij końcówkę palcem wskazującym, aby zablokować przepływ gazu wewnątrz końcówki.

Wyciągnij końcówkę pionowo, trzymając zawartość studzienki w końcówce podczas jej wyciągania. Dodaj 80 mikrolitrów nocnej kultury wzrostu do każdej studzienki. Płytki roju należy wyjmować z inkubatora pojedynczo co 12 godzin i umieszczać je w systemie obrazowania żelu.

Wybierz tryb obrazowania żelowego, wystaw płytkę roju na działanie białego światła i dostosuj ogniskową, aby uzyskać wyraźny widok rojów. Zwiększ jasność rojów, aby uzyskać precyzyjną obserwację, dostosowując czas ekspozycji do 300 milisekund. Dostosuj próg, aby zminimalizować zakłócenia powodowane przez światło tła.

Zapisz plik obrazu do dalszej analizy. Zapisz czas obrazowania, typ induktora, orientację gradientu i odkształcenia w pliku txt. Kliknij opcję Proces, a następnie Cienie, aby poprawić ostrość obrazu.

Kliknij Proces, a następnie Partia, aby przetworzyć obraz. Następnie przetwórz obraz jako odniesienie, klikając Proces, Cienie i Południe. Kliknij przycisk Proces, Partia, Makro, aby otworzyć okno Proces wsadowy.

Poszukaj poleceń wyświetlanych w oknie. Wpisz adres folderu oryginalnych obrazów w adresie pliku wyjściowego, klikając przycisk Proces w oknie Proces wsadowy. Użyj narzędzia do śledzenia różdżek, aby wybrać roje pojedynczo i kliknij dwukrotnie narzędzie do śledzenia różdżki, aby dostosować tolerancję, aż wygenerowana linia będzie prawidłowo pasować do granicy roju.

Kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby wyeksportować wartość obszaru. E.coli K12 YdeH przetestowano na płytkach gradientowych arabinozy użytych do zademonstrowania procesu rojenia się powierzchni z nakładaniem się na siebie między sąsiednimi studzienkami. Płyta z trzema dołkami testowymi umożliwiła utworzenie nienakładających się na siebie granic.

Ruchliwość roju P.aeruginosa PAO1 YdeH była promowana ze zwiększonym stężeniem arabinozy od najniższego stężenia, ale stopniowo ograniczanym przy wyższych stężeniach stężeń arabinozy. Szczepy E.coli K12 typu dzikiego testowane na płytkach gradientowych resweratrolu w zakresie stężeń od zera do 400 mikrolitrów wykazały umiarkowane ograniczenie ruchliwości roju wraz ze wzrostem stężenia resweratrolu. Obszary roju zostały określone ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.

Krzywa roju wyświetlała wielokrotne reakcje stężenia. Najważniejszą częścią tej procedury jest wyprodukowanie dwuwarstwowej płytki roju o określonym zakresie stężeń induktorów. Metoda ta umożliwia naukowcom zbadanie indukowanego roju powierzchniowego w określonym zakresie stężeń oraz ilościowe określenie wpływu innych induktorów i składników na rój.