Obrazowanie biomolekularne wychwytu komórkowego nanocząstek przy użyciu multimodalnej nieliniowej mikroskopii optycznej
16 maja 2022
Ten artykuł przedstawia integrację modułu spektralnego ogniskowania i lasera impulsowego o podwójnym wyjściu, umożliwiającego szybkie obrazowanie hiperspektralne nanocząsteczek złota i komórek rakowych. Praca ta ma na celu zademonstrowanie szczegółów multimodalnych nieliniowych technik optycznych na standardowym laserowym mikroskopie skaningowym.
Nasz protokół przedstawia multimodalną, nieliniową mikroskopię optyczną i stosuje ją do wykonywania specyficznego chemicznie obrazowania nanocząstek złota w komórkach nowotworowych. Główną zaletą naszego systemu obrazowania jest to, że można go wykorzystać do przeglądu kontrastu biomolekularnego struktur komórkowych i nanocząstek złota w sposób multimodalny. Aby rozpocząć, włącz wtyczki wszystkich urządzeń, z wyjątkiem skrzynki pilota.
Następnie włącz tylną część skrzynki i naciśnij Rozpocznij operację, gdy kontrolka pilota na skrzynce sterowniczej zmieni kolor na niebieski. Następnie włącz komputer laserowego mikroskopu skaningowego i uruchom oprogramowanie mikroskopu konfokalnego. Następnie sprawdź drogę światła mikroskopu za pomocą oprogramowania komputerowego i kontroluj ostrość za pomocą ekranu dotykowego lub pokręteł pilota zdalnego sterowania lub oprogramowania komputerowego.
Wybierz żądane ustawienia obrazu w oprogramowaniu, w tym powiększenie, rozmiar obrazu w pikselach i czas zatrzymania piksela, upewniając się, że czas przebywania piksela jest dłuższy niż czas integracji. Umieść kroplę wody destylowanej na obiektywie zanurzenia w wodzie, który skupia wiązki laserowe w próbce i między skraplaczem a próbką w celu obrazowania. Następnie dostosuj wysokość kondensatora do około jednego milimetra nad próbką, aby zebrać maksymalną ilość światła i przesuń detektor SRS umieszczony na ruchomym uchwycie poza ścieżkę wiązki, aby skupić się na próbce za pomocą światła białego.
Korzystając z ustawień oprogramowania, wybierz wiązkę pompy i zmień długość fali lasera na 802 nanometry dla drgań CO i 898 nanometrów dla piku amidu I, uwzględniając duże zmiany w przesunięciu Ramana. Aby uzyskać niewielkie korekty w przesunięciu Ramana, zeskanuj stopień opóźnienia w jednostce SFTRU zgodnie z opisem w manuskrypcie. Dla zestawu danych hiperspektralnych wybierz kartę Wyzwalacz, kliknij pozycję Rozpocznij od wyzwalacza ttl włączone, a następnie wybierz opcję Wyzwalaj co klatkę.
Następnie na karcie Serie ustaw szereg czasowy włączony i wyłączony szereg Z. Ponadto należy ustawić liczbę ramek w szeregach czasowych tak, aby odpowiadała liczbie kroków w oprogramowaniu ATM. Następnie przejdź do zakładki Uruchom w oprogramowaniu ATM i ustaw pozycje stopnia opóźnienia dla CH na 90,25 i 92,25, natomiast dla obszaru amidu I na 89 i 91 w milimetrach, odpowiadające pozycji początkowej i końcowej skanowania hiperspektralnego, upewniając się, że liczba kroków odpowiada liczbie klatek w oprogramowaniu komputerowym.
Po sprawdzeniu poprawnych ustawień uruchom stos hiperspektralny w oprogramowaniu komputerowym, przechodząc najpierw do Pobierz, a następnie klikając Rozpocznij skanowanie. Następnie w oprogramowaniu ATM kliknij przycisk Start, który inicjuje zbieranie serii obrazów z przyrostowymi wzrostami pozycji stopnia opóźnienia między wybranymi pozycjami startu i zatrzymania. Następnie wykonaj serię zdjęć w różnych pozycjach etapu opóźnienia, aby wygenerować skan hiperspektralny.
Korzystając z jednostki analogowej, wysyłaj i odbieraj sygnały ttl do iz systemu SFTRU w celu synchronizacji akwizycji obrazu i ruchu stopnia opóźniającego. Aby przełączać się między obrazowaniem w obszarze wibracyjnym CH a obszarem wibracyjnym amidu I, zmień długość fali pompy w oprogramowaniu lasera z 802 nanometrów na 898 nanometrów. Ponadto zmień ustawienie dyspersji Stokesa w oprogramowaniu ATM z 30 milimetrów na 5 milimetrów.
Wyreguluj dolne pokrętło na uchwycie lusterka, aby dokonać niewielkiej regulacji lustra w ścieżce dyspersji wiązki pompy wewnątrz skrzynki SFTRU, zmieniając kąt lustra o przyrostową wartość. Aby potwierdzić selektywność chemiczną mikrosfer polistyrenu, zarejestrowano hiperspektralne rozpraszanie Ramana i spontaniczne widma Ramana. Widma były identyczne, z wyjątkiem różnicy zaobserwowanej we względnym natężeniu.
Obrazowanie stymulowanego rozpraszania Ramana komórek nowotworowych 4T1 przeprowadzono przy 2 852, 2 930 i 2 968 liczbach falowych, odpowiadających zakresowi oscylacyjnemu węgiel-wodór rozciągającego biomolekuły lipidów, białek i DNA. Przeprowadzono multimodalne obrazowanie komórek nowotworowych 4T1, którym podawano nanocząstki złota, w celu zbadania rozmieszczenia nanocząstek w komórkach nowotworowych. Uzyskane obrazy wymuszonego rozpraszania Ramana uzyskano dla kanału CH2 i CH3, sond fluorescencyjnych LysoTracker oraz kanału rozpraszania Ramanowskiego stymulowanego rezonansem.
Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest zmiana obszaru wibracji, odniesienia pompy, w oprogramowaniu lasera, a także ustawienia dyspersji Stokesa podczas protokołu. System ten można łatwo przełączać z obszaru femtosekundowego na pikosekundowy bez wpływu na wyrównanie optyczne. Ta zdolność pozwala nam na wykonywanie wielofotonowego, koherentnego rozpraszania Ramana i spektroskopii z sondą pompową oraz ich zastosowania.
Ta multimodalna platforma obrazowania dostarcza nowych informacji na temat nanomedycyny i toruje drogę do obrazowania molekularnego komórek, tkanek i nanocząstek złota.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono multimodalną technikę nieliniowej mikroskopii optycznej do obrazowania specyficznego chemicznie nanocząsteczek złota w komórkach nowotworowych. System obrazowania umożliwia analizę kontrastu biomolekularnego w strukturach komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Obrazowanie biomedyczne
Wstęp
- Nanocząstki złota są wykorzystywane w badaniach nad rakiem w celach obrazowania oraz w zastosowaniach terapeutycznych.
- Nieliniowe techniki optyczne zwiększają możliwości obrazowania.
- Obrazowanie multimodalne dostarcza szczegółowych informacji na temat struktur komórkowych.
- Standardowe mikroskopy skaningowe z laserem mogą zostać przystosowane do zaawansowanych technik obrazowania.
Cel badania
- Integracja modułu ogniskowania spektralnego z laserem impulsowym o podwójnym wyjściu.
- Umożliwienie szybkiego obrazowania hiperspektralnego nanocząstek złota oraz komórek nowotworowych.
- Zaprezentowanie zastosowania multimodalnych nieliniowych technik optycznych.
Zastosowane metody
- Włączanie urządzenia i jednostki sterującej.
- Wykorzystanie oprogramowania mikroskopu konfokalnego do obrazowania.
- Kontrola drogi światła i ostrości za pomocą różnych interfejsów.
- Wykonanie obrazowania w celu oceny kontrastu biomolekularnego.
Główne wyniki
- System obrazowania pomyślnie rejestruje szczegółowe obrazy nanocząsteczek złota w komórkach nowotworowych.
- Obrazowanie multimodalne wykazuje znaczący kontrast biomolekularny.
- Zintegrowany system pozwala na szybkie obrazowanie hiperspektralne.
- Badanie wykazuje skuteczność nieliniowych technik optycznych w mikroskopii.
Wnioski
- Integracja zaawansowanych technik obrazowania usprawnia badanie komórek nowotworowych.
- Podejście to może prowadzić do lepszego zrozumienia struktur komórkowych.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne obszary badań biomedycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multimodalna nieliniowa mikroskopia optyczna umożliwia obrazowanie o specyficzności chemicznej nanocząsteczek złota w komórkach nowotworowych, zapewniając wysoką rozdzielczość kontrastu biomolekularnego, która jest kluczowa dla badań i rozwoju w nanomedycynie. Platforma ta wspiera precyzyjną lokalizację i charakterystykę poboru nanocząsteczek, co wpływa na projektowanie i optymalizację funkcjonalizowanych nanomateriałów do ukierunkowanego dostarczania. Integracja wielu nieliniowych sygnałów optycznych zwiększa pewność predykcyjną na styku biologii odkrywczej i badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację oddziaływań nanocząstek z komórkami w celu mechanistycznej redukcji ryzyka.
- Wspiera walidację funkcjonalną celowania i poboru nanocząstek w odpowiednich kontekstach komórkowych.
- Zapewnia mapowanie przestrzenne i chemiczne w celu wyjaśnienia biologicznych ścieżek dystrybucji nanocząstek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych testów obrazowania do badania lokalizacji i transportu nanocząstek.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do oceny porównawczej formulacji nanocząstek.
- Wspiera standaryzację i skalowalność testów w celu wysokoprzepustowego screeningu kandydatów na nanomateriały.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników obrazowania do istotnych dla danej choroby modeli komórkowych w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Pozwala na ocenę biodystrybucji nanocząsteczek w przedziałach perikomórkowych i wewnątrzkomórkowych.
- Dostarcza danych z obrazowania molekularnego niezbędnych do podejmowania decyzji dotyczących dalszego rozwoju w fazie przedklinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta multimodalna metoda obrazowania łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając wysokotreściową, chemicznie specyficzną wizualizację poboru i dystrybucji nanocząsteczek w komórkach nowotworowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań nanocząsteczek z komórkami oraz aktywacji szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych i powtarzalnych danych obrazowych do porównywania kandydatów.
- Analityka: Generuje hiperspektralne i multimodalne odczyty do rzetelnej analizy statystycznej.
- Badania translacyjne: Łączy obrazowanie in vitro z walidacją kandydatów na nanoleki w modelach przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy bazę platformową dla prowadzenia ciągłych badań nad obrazowaniem nanomateriałów i komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie celowania nanocząsteczek i mechanizmów ich pobierania.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne przepływy pracy w obrazowaniu do zastosowań w wielu projektach.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań nad kandydatami w nanomedycynie poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację formulacji nanocząsteczek do dalszego rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie nieliniowej mikroskopii optycznej i obrazowania hiperspektralnego.
- Wymaga zaawansowanej aparatury, w tym laserów z możliwością strojenia oraz zsynchronizowanych systemów detekcji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i przepływów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych typów komórek lub systemów nanomateriałowych.
- Przepustowość obrazowania i przygotowanie próbek muszą być zrównoważone z głębią analizy.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Operating on the Laser Scanning Microscope
1:30
Mounting a Sample in the Microscope Stage
2:05
Changing the Raman Shift and Collecting a Hyperspectral Data Stack
5:01
Results: Hyperspectral Imaging of Gold Nanoparticles and Cancer Cells
6:16
Conclusion
