Wizualizacja ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej
15 lutego 2022
Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ruchliwości bakterii na podstawie reakcji kolorystycznej. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest łatwa do oceny i dokładniejsza oraz nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
Wykrywanie ruchliwości bakterii jest ważne, ponieważ ruchliwość ma kluczowe znaczenie dla patogenności. Opisany tutaj protokół jest niezawodną metodą wykrywania ruchliwości bakterii, ponieważ opiera się na reakcji barwnej TTC z wewnątrzkomórkowymi dehydrogenazami żywych bakterii. Metoda agaru półstałego TTC do wykrywania ruchliwości bakterii jest prosta, łatwa w obsłudze i nie wymaga dużych i drogich instrumentów.
Metoda może być stosowana przez mikrobiologów klinicznych lub badaczy do badania bakterii chorobotwórczych. Procedurę zademonstruje Xiyi Zhuang, starszy eksperymentator z mojego laboratorium. Na początek przygotuj tradycyjną półstałą pożywkę, dodając 10 gramów tryptozy, 15 gramów chlorku sodu i cztery gramy agaru w odpowiedniej objętości wody destylowanej.
Dostosuj pH do 7,2 i uzupełnij końcową objętość do 1 000 mililitrów. Autoklawuj pożywkę w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut i dozuj pożywkę do 10-mililitrowych probówek na wysokość trzech centymetrów. Aby przygotować pożywkę TTC, schłodź autoklawowane tradycyjne podłoże do 50 stopni Celsjusza, a następnie dodaj pięć mililitrów sterylnego 1% roztworu TTC do 100 mililitrów pożywki.
Wymieszaj i dozuj pożywkę do 10-mililitrowych probówek na wysokość trzech centymetrów. Pobrać pojedyncze kolonie bakterii z płytek agarowych i zaszczepić je w obu półstałych pożywkach przez nakłucie za pomocą igieł do zaszczepiania. Należy pamiętać, aby włączyć szczepy niemodalne jako kontrole ujemne, a szczepy modalne jako kontrole pozytywne.
Aby zaobserwować wpływ stężenia agaru na ruchliwość bakterii, należy przygotować półstałe podłoża zawierające różne stężenia agaru i zaszczepić je przez nakłucie. Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i obserwować wyniki po 24 do 48 godzinach inkubacji. Jeśli tylko linia nakłucia jest czerwona, scharakteryzuj bakterie jako niemodalne.
Jeśli czerwony kolor rozprzestrzenia się na zewnątrz wzdłuż linii nakłucia, scharakteryzuj bakterie jako modalne. Ruchliwość bakterii porównano dla różnych szczepów na podłożach tradycyjnych i półstałych TTC i podsumowano w tej tabeli. Po 24-godzinnym hodowaniu na półstałym podłożu TTC, Staphylococcus aureus wykazał wzrost wzdłuż zaszczepionej linii.
Natomiast Escherichia coli wykazywała wzrost we wszystkich kierunkach wokół zaszczepionej linii. Największą ruchliwość dla Escherichia coli zaobserwowano w pożywce półstałej TTC przygotowanej z 0,3% agarem, w której pożywka zmieniła kolor na prawie całkowicie czerwony. Natomiast obszar czerwonej dyfuzji zmniejszył się w 0,5% agarze i dyfuzja została przedłużona wraz ze wzrostem stężenia agaru do 0,8%Ważne jest, aby dostosować pH do 7,2 i schłodzić autoklawowane podłoże do 50 stopni Celsjusza przed inokulacją za pomocą igieł.
Bakterie należy zaszczepić przez nakłucie w półstałej pożywce zawierającej TTC. Jest to bezpośrednia metoda wykrywania ruchliwości bakterii. Możliwe jest również pośrednie wykrycie ruchliwości za pomocą mikroskopu elektronicznego i
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia wiarygodny protokół wykrywania ruchliwości bakterii, która jest kluczowa dla zrozumienia patogenności. Metoda opiera się na reakcji barwnej TTC z wewnątrzkomórkowymi dehydrogenazami żywych bakterii, oferując prosty i dokładny sposób wymagający minimalnego wyposażenia.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ruchliwość bakterii i jej znaczenie w patogenności
- Mikrobiologia kliniczna i metodologie badawcze
- Testy kolorymetryczne w detekcji drobnoustrojów
Wstęp
- Znaczenie ruchliwości bakterii w przebiegu chorób
- Istniejące metody wykrywania ruchliwości oraz ich ograniczenia
- Potrzeba opracowania niezawodnej i dostępnej metody
Zastosowane metody
- Metoda agaru półpłynnego z TTC
- Różne szczepy bakteryjne, w tym Staphylococcus aureus i Escherichia coli
- Kolorymetryczna ocena ruchliwości
Główne wyniki
- Staphylococcus aureus wykazuje wzrost wzdłuż linii nakłucia, co wskazuje na ograniczoną ruchliwość
- Escherichia coli wykazała rozległy wzrost, co świadczy o większej ruchliwości w podłożu TTC
- Metoda ta skutecznie różnicuje bakterie ruchliwe i nieruchliwe
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia prostą metodę oceny ruchliwości bakterii, która ma kluczowe znaczenie w badaniach nad patogenami.
- Dostępność tego protokołu sprawia, że jest on wartościowy zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne wykrywanie ruchliwości bakterii jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów patogenności, tworzenia biofilmu oraz oporności na leki we wczesnych etapach poszukiwania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Kolorymetryczny test oparty na TTC umożliwia zstandaryzowaną, ilościową ocenę fenotypów ruchliwości, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. Metoda ta dostarcza dostępnych i powtarzalnych wyników, które pomagają w selekcji portfolio oraz w dostosowanym do ryzyka rozwoju projektów w obszarze badań i rozwoju nad chorobami zakaźnymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę ruchliwości jako czynnika wirulencji u bakterii patogennych.
- Wspiera biologiczną weryfikację ryzyka poprzez rozróżnienie szczepów modalnych i niemodalnych w określonych warunkach.
- Dostarcza ilościowych, powtarzalnych danych fenotypowych do walidacji celów oraz badań mechanistycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych testów ruchliwości do procesów przesiewowych związków chemicznych.
- Zapewnia ustandaryzowane wyniki kolorymetryczne, które są łatwe w interpretacji i porównywaniu pomiędzy eksperymentami.
- Umożliwia skalowalne wdrożenie testów przy niskich nakładach infrastrukturalnych, zapewniając gotowość do wysokoprzepustowego przesiewania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje fenotypowanie ruchliwości z zachowaniami bakteryjnymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, łącząc ruchliwość in vitro z potencjalną patogennością in vivo.
- Stanowi platformę do oceny wpływu zmiennych środowiskowych na fenotypy ruchliwości.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten test ruchliwości oparty na TTC wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, umożliwiając solidny screening fenotypowy oraz walidację celów dla portfolio leków przeciwdrobnoustrojowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących patogennych mechanizmów napędzanych ruchliwością oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki kolorymetryczne służące do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia bezpośrednie porównanie fenotypów ruchliwości między różnymi szczepami i warunkami przy użyciu mierzalnych wzorów dyfuzji.
- Badania translacyjne: Łączy dane o ruchliwości in vitro z zachowaniami bakteryjnymi istotnymi dla przebiegu choroby, w przypadku wsparcia przez modele następcze.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje wielokrotnego użytku, niskokosztową platformę do oceny ruchliwości różnych gatunków bakterii i programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w odkrywaniu leków przeciwinfekcyjnych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne testy ruchliwości bez konieczności stosowania specjalistycznej aparatury.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka fenotypowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki przeciwinfekcyjne w oparciu o funkcjonalne dane dotyczące ruchliwości.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu mikrobiologii w celu przygotowania testu i interpretacji wyników.
- Minimalne wymagania sprzętowe, ograniczające się do standardowych inkubatorów i podstawowych materiałów laboratoryjnych.
- Standaryzacja stężenia agaru, pH oraz warunków inkubacji jest kluczowa dla powtarzalności badań.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla wielu gatunków bakterii i zróżnicowanych warunków środowiskowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują wrażliwość na warunki wzrostu oraz konieczność użycia żywych, metabolicznie aktywnych bakterii.
