Mapowanie bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczki
11 listopada 2025
Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek przylegających przy użyciu tesselacji Voronoi danych z mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki, znanej objętości, rozmiaru genomu oraz etapu cyklu komórkowego.
Obecna metoda pozwala na pomiary bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórkowych w celu badania ograniczeń przestrzennych struktur chromatyny, które w przeciwnym razie charakteryzują się jedynie modyfikacjami histonów po translacji. Tesselacja Voronoi w połączeniu z SMLM pozwala na bezwzględne oszacowanie gęstości DNA w zależności od par zasad na mikrometr kwadratowy. Jedyną potrzebną wiedzą apriori jest całkowita zawartość DNA w mierzonym jądrze komórki.
W przyszłych eksperymentach ciekawe będzie zbadanie, czy bezwzględne różnice gęstości korelują z informacjami biologicznymi pochodzącymi z innych metod, takich jak immunofluorescencja modyfikacji epigenetycznych czy dane Hi-C. Zacznij od odtworzenia zeskanowanego obszaru, łącząc wcześniej nagrane pojedyncze obrazy. Otwórz CellProfiler i załaduj pipeline cellcycleanalysis.cpproj.
W pierwszym kroku obrazów pipeline przeciągnij i upuść obrazy, w tym obraz referencyjny. Następnie określ miejsce, w którym będą przechowywane obrazy referencyjne. Następnie kliknij ikonę Start Test, a następnie Uruchom.
Gdy histogram jąder na analizowanym obrazie zostanie wyświetlony, określ interwały intensywności dla faz G1, S i G2 oraz upewnij się, że są one wprowadzone w kolejnych etapach obiektu filtru w potoku oraz że te kroki są aktywne. Następnie kliknij ponownie przycisk Run, aby kontynuować drugą połowę pipeline. Spójrz na trzy zdjęcia z nakładkami reprezentującymi różne etapy cyklu komórkowego, G1, S lub G2, i wybierz jądra w G1 lub G2 do dalszego obrazowania, aby ilość DNA w parach zasad jąder obrazowych była znana.
Przemieszczenie komórek na mikroskopie lokalizacyjnym pojedynczątkowej i zapewnienie prawidłowego mrugania procesu FPALM. Najpierw nagraj stos 3D wybranego jądra, używając tylko 500 klatek na fragment. Pozwala to określić względną ilość DNA w środkowej części ciała, które później jest obrazowane z wieloma ramkami, aby odsłonić jego ultrastrukturę.
Rozpocznij akwizję serii zdjęć z czasem naświetlania 50 milisekund, co daje szybkostrzelność około 20 klatek na sekundę. Przeprowadź stos Z przez jądro z odstępami krokowymi 200 nanometrów i tylko 500 klatek na przekrój optyczny światła. Po pozyskaniu stosu wróć do początkowej pozycji z i pobierz główny zestaw danych 50 000 klatek z tym samym czasem ekspozycji wynoszącym 50 milisekund.
Otwórz zbiór danych FPALM w ImageJ. Aby zoptymalizować ustawienia wykrywania sygnałów, kliknij ThunderSTORM, a następnie Uruchom analizę. Teraz wybierz ustawienie kamery.
Wprowadź poprawny rozmiar pikseli danych obrazu, liczbę A/D, efektywność kwantową używanego aparatu, poziom bazowy i wzmocnienie elektromagnetyczne, a następnie kliknij OK. Wybierz algorytm do określenia współrzędnych lokalizacji, dopasowując sygnały. W sekcji filtrowania obrazów użyj filtra falkowego B-Spline z B-Spline rzędu 3 i skalą B-Spline 2. Następnie ustaw metodę przybliżonej lokalizacji cząsteczek na maksimum lokalne, ustaw próg maksymalnej intensywności szczytowej i łączność na ośmiokątne sąsiedztwo.
W sekcji lokalizacji cząsteczek subpikselowych, jako metodę, wybierz zintegrowany Gaussian z PSF, ustaw promień dopasowania px na 3, wybierz metodę dopasowania jako maksymalne prawdopodobieństwo i ustaw początkową sigmę na 1,6. Następnie kliknij OK, aby rozpocząć wykrywanie sygnałów i rekonstrukcję obrazu. Jeśli akwizycja jest podzielona na różne stosy obrazów, połącz tabele lokalizacyjne w ThunderSTORM.
Aby to zrobić, kliknij Import w oknie wyskakującym (pop-up). Upewnij się, że opcja Dodaj do bieżącej tabeli jest aktywowana oraz że użyto poprawnej liczby początkowej, aby uniknąć nadpisywania lokalizacji w tabeli. Następnie wybierz ścieżkę do pliku i kliknij OK, aby zaimportować jeden plik po drugim.
Aby zapobiec nadmiernemu liczeniu sygnałów w kolejnych klatkach, połącz dane lokalizacyjne z maksymalną odległością 20 nanometrów, 1 maksymalną liczbą klatek niedostępnych i 0 maksymalnych klatek na cząsteczkę, a następnie kliknij Merge. Aby zmierzyć i skorygować dryf poprzez krzyżowe korelacje podsekcji danych, otwórz menu Korekcji dryfu i kliknij strzałki. Dodaj 3 pojemniki i ustaw powiększenie na 5.
Następnie kliknij Apply, a pojawi się okno pokazujące dryf x i y. Aby określić ilość sygnału proporcjonalną do zawartości DNA w każdym przekroju wcześniej nagranego stosu 3D z 500 klatkami dla każdego fragmentu, wybierz Wtyczki, następnie ThunderSTORM, następnie Import/Eksport i importuj tabelę wyników dla pierwszego fragmentu stosu. Aby uniknąć nadmiernego liczenia sygnałów z innych planów obrazu stosu 3D, należy usunąć sygnały spoza 200-nanometrowego odstępu krokowego w z między fragmentami.
Naciśnij histogram Plot i w otwartym dialogu Dystrybucja wybierz z i naciśnij OK. Określ pozycję piku i użyj pola filtra do wyboru sygnałów o optycznym kroku 200 nanometrów. Kliknij na Wizualizację i wybierz opcję Histogramów, a następnie OK. Zapisz powstały obraz w folderze w formacie TIFF. Otwórz wszystkie fragmenty i połącz je za pomocą Obrazu, następnie Stosów, a następnie Obrazów do stosu.
Po zaznaczeniu całego obszaru obrazu przejdź do Analizuj, kliknij Narzędzia i wybierz Menedżera ROI. Kliknij Dodaj (Dodaj), następnie Analizuj, następnie Zestaw pomiarów i wybierz Zintegrowana gęstość. Teraz wybierz opcję Więcej, wybierz Wielokrotne miary, zaznaczy Mierz wszystkie stosy oraz Jeden wiersz na kawałek.
Kliknij OK, a pojawią się wyniki. Suma intensywności wszystkich przekrojów jest proporcjonalna do zawartości DNA w całym jądrze, tak jak intensywności poszczególnych przekrojów są proporcjonalne do ich ułamku w całym genomie. Po otwarciu tabeli wyników płaszczyzny centralnej, która zawiera sygnały 50 000 klatek, przefiltruj ją do grubości 100 nanometrów.
Stwórz histogram powstałych sygnałów, jak pokazano wcześniej, i zmierz całkowitą gęstość sekcji środkowej. Przekonwertuj dużą tabelę lokalizacji ThunderSTORM zawierającą informacje ultrastrukturalne z sekcji centralnej z formatu csv do formatu ORTE, uruchamiając skrypt MATLAB TS2orte. m, który przekształca tabelę lokalizacyjną w macierz MATLAB i zapisuje ją w formacie MAT.
Wejdź do folderu LAND-voronoi, a w podfolderze coreAlgorithm otwórz zestaw plików voronoicluster. m oraz dostosowują zawartość DNA, ułamek obserwowanego centralnego przekroju całego ułamku jądra DNA oraz lokalizacje oraz współczynnik konwersji zgodnie z typem komórki i etapem cyklu komórkowego do obliczeń gęstości bezwzględnej. Edytuję skrypt, który rozpoczyna analizę voronoi.m.
Dostosuj ścieżkę pliku do danych lokalizacji orte oraz folderu wyjściowego dla plików wyników. Określ współrzędne definiujące obszar, w którym należy wykonać tesselację. Zdefiniuj wiele obszarów do obliczeń w tym samym zbiorze danych wejściowych.
Po uruchomieniu skryptu poszukaj obrazu pokazującego bezwzględne gęstości DNA wraz z innymi plikami zawierającymi wykresy pokazujące histogram rozkładu powierzchni oraz gęstości. m zawierającym gęstości każdej pojedynczej obliczonej komórki Voronoi w folderze wyjściowym. Pomiar FPALM, obejmujący 50 000 klatek, dał wykrycie lokalizacji w obrębie 100-nanometrowej grubości w obszarze środkowym o grubości 2,68 razy 100 razy 100 razy 100 000.
Dokładność lokalizacji zrekonstruowanego obrazu wyniosła 10 nanometrów. Duża liczba lokalizacji umożliwiła połączenie obrazowania superrozdzielczości z pokazem absolutnej gęstości DNA. Było oczywiste, że zmierzone gęstości DNA nie były równomiernie rozłożone w całym jądrze i obejmowały szeroki zakres dynamiczny.
Większe powiększenia obszarów w jądrze pokazujące większe komórki Voronoi wskazywały na niską gęstość DNA, podczas gdy mniejsze komórki wskazywały na wysoką gęstość DNA. Gęstość DNA mierzona w G1C3H10T półjądrze wykazała bezwzględny rozkład gęstości DNA w jądrze innego typu i gatunku. Chociaż podstawowa struktura przypominała wczesne jądro G1 HeLa, posiadała także skupiska paracentrycznej heterochromatyny.
Nie zaobserwowano dramatycznych zmian architektonicznych w jądrze G2, mimo nieznacznie zwiększonego rozmiaru jądra. Jądro HeLa poddane TSA wykazywało znaczące różnice pod względem topografii jądrowej i gęstości DNA. Z wyjątkiem obwodowej heterochromatyny, która wykazywała wyspy o wyższej gęstości DNA, reszta chromatyny wyglądała znacznie bardziej jednorodnie i zdekondensowana.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje metodę pomiaru bezwzględnej gęstości DNA w jądrach komórek adherentnych z wykorzystaniem teselacji Voronoi danych z mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM). Podejście to umożliwia badanie ograniczeń przestrzennych w strukturach chromatyny, łącząc informacje genetyczne z etapami cyklu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Biologia komórki
- Genetyka
- Mikroskopia i techniki obrazowania
Wstęp
- Zrozumienie gęstości DNA jest kluczowe dla badania architektury chromatyny.
- Obecne metody często opierają się na modyfikacjach po translacyjnych histonów.
- Znajomość całkowitej zawartości DNA jest niezbędna do dokonania dokładnych pomiarów.
Zastosowane metody
- Tesselacja Voronoi danych SMLM
- Jądra komórek adherentnych jako system biologiczny
- Oprogramowanie do analizy obrazu, takie jak CellProfiler i ImageJ
Główne wyniki
- Pomiary pozwalają na wyznaczenie gęstości DNA wyrażonej w parach zasad na mikrometr kwadratowy.
- Kierunki przyszłych badań obejmują korelację różnic w gęstości z modyfikacjami epigenetycznymi.
- Metoda potwierdza wpływ etapów cyklu komórkowego na pomiar zawartości DNA.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia precyzyjną ocenę gęstości DNA w jądrach komórkowych.
- Badanie to toruje drogę do integracji danych genomicznych z fizycznymi właściwościami chromatyny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe mapowanie absolutnej gęstości DNA w jądrach komórkowych wypełnia krytyczną lukę w zrozumieniu architektury chromatyny wykraczającą poza markery epigenetyczne, umożliwiając bezpośrednią ocenę ograniczeń przestrzennych, które mogą wpływać na regulację genów. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków, dostarczając wysokorozdzielczych, ilościowych danych na temat organizacji jądra, istotnych dla walidacji celu i redukcji ryzyka mechanistycznego. Integracja takich pomiarów gęstości DNA o rozdzielczości przestrzennej wspiera decyzje dotyczące portfolio skorygowane o ryzyko w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednie badanie przestrzennej organizacji chromatyny w celu walidacji funkcjonalnych celów.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację zmienności gęstości DNA powiązanej ze stanami aktywności genów.
- Zapewnia ilościowe ramy do testowania hipotez dotyczących ograniczeń przestrzennych w regulacji genów.
Przesiewanie i opracowywanie testu
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli jąder komórkowych do dalszych analiz chromatyny lub analiz epigenetycznych.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki gęstości DNA w celu standaryzacji testów.
- Umożliwia rzetelne porównanie stanów chromatyny w różnych fazach cyklu komórkowego i warunkach traktowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie mapowania gęstości chromatyny do fenotypów jądra istotnych dla danej choroby w przypadku integracji z danymi ortogonalnymi.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie fizycznych cech chromatyny z odczytami funkcjonalnymi.
- Umożliwia predykcyjne ograniczanie ryzyka w przypadku strategii terapeutycznych ukierunkowanych na chromatynę.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta znajduje się w kontinuum procesu badawczego, od wczesnego testowania hipotez po dopracowywanie modeli przedklinicznych, umożliwiając integrację przestrzennych danych o chromatynie z analizami funkcjonalnymi i epigenetycznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania oparte na hipotezach dotyczące przestrzennych ograniczeń chromatyny oraz ich implikacji regulacyjnych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych i powtarzalnych wskaźników gęstości DNA do rozwoju testów i przesiewania związków.
- Analityka: Generuje wysokorozdzielcze, statystycznie wiarygodne mapy gęstości do analizy porównawczej w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Umożliwia powiązanie architektury chromatyny z modelami chorób w połączeniu z dodatkowymi danymi molekularnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny i możliwy do ponownego wykorzystania schemat pracy dla analizy architektury jądra w różnych typach komórek i warunkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii chromatyny.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pomiar gęstości jądra przy wysokiej powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez dostarczenie ilościowych danych przestrzennych na temat organizacji chromatyny.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i strategii modyfikacji chromatyny z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dziedzinie mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek oraz zaawansowanej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do platform mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości oraz infrastruktury obliczeniowej do przetwarzania danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i analizy pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja metody do różnych typów komórek i faz cyklu komórkowego wymaga precyzyjnej kalibracji zawartości DNA oraz parametrów segmentacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność dokładnego określenia całkowitej zawartości DNA oraz potencjalną integrację z ortogonalnymi danymi molekularnymi.
