Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym
5 czerwca 2026
Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.
Nasze badania analizują epigenetyczny skład domen pakujących chromatynę oraz to, jak czynniki regulacyjne kształtują ich strukturę i funkcję. Protokół ten jest najbardziej przydatny do badania relacji przestrzennych między celami a gęstymi środowiskami komórkowymi, takimi jak jądro. Na początek zważ albuminę surowicy bydłej, tak aby końcowe stężenie w wymaganej objętości buforowej dla eksperymentu wynosiło 3%. Dodaj albuminę surowicową do probówki wirówki.
Przechyl rurkę wirówki pod kątem 45 stopni, aby rozprowadzić kryształy albuminy surowicy bydlęcej, a następnie dodaj PBS do probówki. Zapobiega to zlepianiu się kryształów. Pozwól wszystkim kryształom albuminy surowicy bydłego rozpuścić się naturalnie w temperaturze pokojowej i unikaj wstrząsania lub wirowania.
Po całkowitym rozpuszczeniu kryształów dodaj Triton X-100, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2%. Jeśli kryształy pozostają, pipetuj roztwór w górę i w dół kilka razy, aby powoli mieszać roztwór, nie tworząc pęcherzyków. Weź żywe komórki z inkubatora. Usuń pożywkę z pożywki komórkowej z naczynia.
Umyj komórki, dodając tyle PBS, by je pokryć, a następnie pipetuj PBS. Następnie pipetować tyle roztworu utrwalającego, aby pokryć komórki i pozostawić je do utrwalenia przez 10 minut. Za pomocą wagi zważ borowodnikiem sodu, aby przygotować roztwór kalący o stężeniu 0,1%.
Dodaj borowodnik sodu do rurki wirówki. Wyciągnij pipetą roztwór utrwalacza z naczynia. Następnie dodaj do naczynia tyle PBS, aby pokryć powierzchnię komórki.
Umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki. Następnie dodaj wymaganą objętość PBS do borowodrówku sodu w rurce wirówki. Przekręć rurkę na worteks, aby wymieszać roztwór hartujący.
Wyjmij miskę z shakera i wyrzuć PBS z naczynia. Dodaj tyle roztworu hartującego, by pokryć powierzchnię naczynia. Następnie umieść talerz na shakerze na siedem minut, aby stłumić autofluorescencję w komórkach.
Resztę roztworu hartującego w rurce wirówki wyrzuć do odpowiednio oznakowanego pojemnika na ciekłe odpady chemiczne. Wyjmij miskę z shakera, a następnie usuń z niej roztwór hartujący. Następnie dodaj tyle PBS do naczynia, by pokryć powierzchnię.
Umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki. Po wysybaniu usuń PBS i powtórz mycie z PBS jeszcze dwa razy. Teraz dodaj wystarczająco dużo bufora blokującego do naczynia, aby pokryć powierzchnię.
Inkubuj naczynie na shakerze przez co najmniej godzinę, aby przeniknąć błony komórkowe i zablokować miejsca wiązania. Aby przygotować pierwotny roztwór do barwienia przeciwciał, należy przenieść wymaganą objętość buforu blokującego do nowej rurki wirówki. Dodaj wymaganą objętość pierwotnego zapasu przeciwciał do buforu blokującego, aby uzyskać końcowe stężenie określone przez producenta.
Następnie wymień bufor blokujący wystarczającą ilością pierwotnego roztworu barwiącego przeciwciała, aby pokryć powierzchnię naczynia i inkubuj na shakerze przez jedną do dwóch godzin lub przez noc. Po inkubacji pierwotnych przeciwciał zastąpi pierwotny roztwór przeciwciał buforem do płukania. Następnie umieść naczynie na shakerze na pięć minut, aby umyć komórki.
Powtórz mycie bufora do prania jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy prania. Przygotuj wtórny roztwór barwienia przeciwciał zgodnie z zalecanym stężeniem. Oblicz całkowitą objętość roztworu barwienia, dodając 0,5 mililitra do objętości potrzebnej do pokrycia komórek.
Przenieś obliczoną objętość z bufora blokującego do nowej rurki wirówki, aby przygotować roztwór barwiący. Następnie dodaj odpowiednią objętość zapasu przeciwciał wtórnych do buforu blokującego, aby uzyskać właściwe końcowe stężenie. Owiń rurkę wirówki zawierającą wtórny roztwór do barwienia przeciwciał folią aluminiową i wymieszaj roztwór przez pipetowanie w górę i w dół.
Dodaj do naczynia wystarczająco dużo wtórnego roztworu przeciwciała, aby pokryć powierzchnię. Umieść miskę na shakerze na 40 minut, aby przywiązać fluorofory do oznaczonych celów komórkowych. Przykryj miskę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.
Po 40 minutach wykonaj dwa mycia PBS, jak pokazano wcześniej. Jeśli preferowane jest przechowywanie, dodaj do talerza wystarczająco dużo PBS, aby pokryć powierzchnię komórki przed przechowywaniem. Owiń naczynie parafilmem, aby zapobiec parowaniu cieczy, a następnie folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu fluoroforem.
Przechowywać zapakowane naczynie w temperaturze czterech stopni Celsjusza aż do momentu przygotowania do zdjęcia. Protokół sekwencyjnego barwienia wygenerował reprezentatywne trójkolorowe obrazy chromatyny dSTORM dla wielu linii komórkowych, w tym komórek BJ Fibroblast, HeLa oraz MCF 10A. Pipeline analityczny został oceniony na podstawie symulowanych zbiorów danych reprezentujących normalne, jednolite rozkłady przestrzenne toroidalne i losowe zakotwiczone w pozycjach klastrów heterochromatycznych.
Wyraźne wzorce organizacji przestrzennej powodowały charakterystyczne profile histogramów odległości, gdy współrzędne lokalizacyjne analizowano względem centroidów heterochromatycznych. Symulowane przestrzennie segregowane markery w normalnej konfiguracji naczyniówki powodowały minimalną gęstość stawów, co skutkowało płaskim profilem rozkładu. Symulowane nakładające się wzory markerów w normalnej konfiguracji losowej powodowały malejącą gęstość łączeń wraz ze wzrostem odległości od punktów odniesienia.
Identyfikacja domen heterochromatyny oparta na badaniu DB umożliwiła kategoryzację na małe, średnie i duże domeny w zależności od efektywnego promienia. Ilościowa analiza odległości wykazała, że polimeraza RNA II i H3K27ac lokalizowane są w pobliżu granic heterochromatyny w małych, średnich i dużych domenach. Analiza gęstości łącznej wykazała szczytową kolokalizację H3K27ac i polimerazy RNA II tuż poza granicami klastrów heterochromatyny.
Dzięki temu protokołowi badacze mogą badać pozornie nieuporządkowaną organizację chromatyny, aby zbadać związek między jej strukturą, elementami regulacyjnymi i wynikami funkcjonalnymi. Zgodnie z tą procedurą, różne analizy obliczeniowe oparte na obrazach lub chmury punktów mogą wyodrębnić ilościowe cechy strukturalne z danych przestrzennych, w zależności od zastosowanej metody obrazowania. Naukowcy mogą rozszerzyć tę metodę oznaczania, optymalizując dodatkowe markery i wykorzystując dane wielokanałowe, aby umożliwić bardziej zaawansowane i kompleksowe analizy.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół sekwencyjnego znakowania immunofluorescencyjnego dla niezawodnej trójkolorowej mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM) w gęstym środowisku jądrowym, umożliwiający wysokiej wierności obrazowanie komponentów chromatyny. Metoda obejmuje zoptymalizowane składy buforów, dobór fluoroforów oraz strategie walidacji przeciwciał w celu zminimalizowania przesłuchów i degradacji sygnału. Jest ona zintegrowana z potokiem analizy obliczeniowej, który wykorzystuje lokalizacje jednego celu jako kotwice przestrzenne do ilościowego określania odległości między celami, gęstości lokalnych oraz współpowinowactwa wieloetykietowego. Protokół został zademonstrowany na komórkach fibroblastów BJ, HeLa oraz MCF 10A i umożliwia szczegółową nanometrową analizę przestrzenną architektury chromatyny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Biologia chromatyny
Wstęp
- Chromatyna wykazuje organizację wielkoskalową, od nukleosomów po domeny o wielkości mikronowej, co wymaga zastosowania wysokorozdzielczych i specyficznych metod obrazowania.
- Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), w szczególności STORM, umożliwia nanoskalowe mapowanie znaczników epigenetycznych.
- Obrazowanie wieloetykietowe w jądrze komórkowym wiąże się z takimi trudnościami jak ograniczona dostępność przeciwciał, wiązanie niespecyficzne oraz niestabilność fluoroforów.
- Istniejące protokoły często nie są wystarczająco odporne na zakłócenia w gęstym środowisku wewnątrzkomórkowym, jakim jest jądro.
Cel badania
- Opracowanie protokołu sekwencyjnego znakowania immunologicznego zoptymalizowanego dla środowisk jądrowych o wysokiej gęstości.
- Umożliwienie stabilnego trójkolorowego obrazowania SMLM z minimalnym przesłuchem i ograniczoną degradacją sygnału.
- Zintegrowanie protokołu z potokiem obliczeniowym w celu ilościowej analizy przestrzennej komponentów chromatyny.
- Zapewnienie powtarzalnych ram metodycznych dla obrazowania wielokomponentowego w gęstych środowiskach subkomórkowych.
Zastosowane metody
- Sekwencyjne znakowanie immunofluorescencyjne z optymalizacją składu buforów i doborem fluoroforów.
- Blokowanie 3% BSA, fiksacja oraz wygaszanie 0,1% borowodorkiem sodu w celu redukcji autofluorescencji.
- Inkubacje z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi z etapami przemywania w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania.
- Obrazowanie dSTORM w warunkach buforowanych w celu stabilizacji fluoroforów.
- Analiza obliczeniowa z wykorzystaniem lokalizacji jednego celu jako punktów startowych do pomiaru odległości międzycelowych i gęstości wspólnych.
- Klasteryzacja oparta na algorytmie DB-scan w celu kategoryzacji domen heterochromatyny według promienia efektywnego.
Główne wyniki
- Protokół pozwolił na uzyskanie reprezentatywnych trójkolorowych obrazów dSTORM w liniach komórkowych fibroblastów BJ, HeLa oraz MCF 10A.
- Dane symulowane wykazały wyraźne profile histogramów odległości w zależności od organizacji przestrzennej markerów względem centroidów heterochromatyny.
- Polimeraza RNA II oraz H3K27ac lokalizowały się w pobliżu granic heterochromatyny w domenach małych, średnich i dużych.
- Analiza gęstości wspólnej wykazała szczytową kolokalizację H3K27ac i polimerazy RNA II tuż poza granicami klastrów heterochromatyny.
- Potok analizy umożliwił kwantyfikację cech strukturalnych z danych w postaci przestrzennych chmur punktów pochodzących z SMLM.
Wnioski
- Protokół sekwencyjnego znakowania immunologicznego umożliwia niezawodną i precyzyjną trójkolorową mikroskopię SMLM w gęstym środowisku jądrowym.
- Integracja z analizą obliczeniową pozwala na nan skalową kwantyfikację przestrzennej organizacji chromatyny.
- Metoda ta zapewnia powtarzalne ramy badawcze do analizy relacji przestrzennych między komponentami chromatyny a czynnikami regulacyjnymi.
- Badacze mogą rozszerzyć to podejście poprzez optymalizację dodatkowych markerów w celu przeprowadzenia kompleksowej analizy wielu celów.
- Niniejszy protokół usprawnia badanie zależności między strukturą a funkcją chromatyny w natywnym kontekście komórkowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół rozwiązuje krytyczny problem w badaniach nad chromatyną: uzyskanie wiarygodnego, multipleksowego obrazowania superrozdzielczego w gęstym środowisku jądrowym, gdzie dostępność przeciwciał i stabilność sygnału stanowią główne ograniczenia. Umożliwiając ilościowe mapowanie w nanoskali znaczników epigenetycznych i czynników regulacyjnych w odniesieniu do domen heterochromatyny, narzędzie to pozwala na mechanistyczną weryfikację i redukcję ryzyka podczas walidacji celów w procesie odkrywania leków epigenetycznych. Zintegrowany potok obliczeniowy przekształca surowe dane lokalizacyjne w praktyczne metryki przestrzenne, wspierając pewność predykcyjną w początkowych etapach testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie relacji przestrzennych między markami chromatyny, czynnikami transkrypcyjnymi a heterochromatyną w celu wyjaśnienia hipotez mechanistycznych w regulacji epigenetycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne ramy dla multipleksowych badań kolokalizacji celów w gęstych środowiskach subkomórkowych.
- Wartość prognostyczna: Ilościowo określa bliskość w nanoskali oraz wspólne powinowactwo między celami, co wspiera priorytetyzację celów w oparciu o kontekst przestrzenny i istotność funkcjonalną.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje zwalidowane, wysokiej wierności dane SMLM w trzech kolorach, odpowiednie do standaryzacji testu i oceny powtarzalności w badaniach nad angażowaniem celów jądrowych.
- Skalowalność: Wspiera rozszerzenie o dodatkowe markery poprzez sekwencyjne znakowanie, co umożliwia skalowalne, wieloparametrowe profilowanie architektury chromatyny.
- Wynik analityczny: Dostarcza mierzalnych cech przestrzennych, takich jak odległości między celami, gęstości lokalne oraz wspólne profile gęstości do późniejszej walidacji trafień w badaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Umożliwia badanie organizacji chromatyny w modelach komórkowych istotnych dla chorób, łącząc modulację celów epigenetycznych z efektami strukturalnymi.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wglądy przestrzenne z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną, zapewniając spójne i mierzalne odczyty obrazowania jądrowego.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów epigenetycznych poprzez bezpośrednią wizualizację ich nanoskalowego środowiska chromatynowego oraz sąsiednich elementów regulacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od generowania hipotez dotyczących celu, po identyfikację związku wiodącego, gdzie przestrzenny kontekst chromatyny dostarcza informacji o możliwości farmakologicznego oddziaływania na cel oraz o mechanizmie działania. Umożliwia ona opracowanie testów gotowych do screeningu poprzez dostarczanie zestandaryzowanych, multipleksowych danych obrazowania jąder komórkowych z wynikami ilościowymi. Potok obliczeniowy dostarcza gotowych do analizy metryk przestrzennych, które wspierają interdyscyplinarne porównywanie wpływu perturbacji chemicznych lub genetycznych na architekturę chromatyny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie znaczników epigenetycznych i czynników regulacyjnych w odniesieniu do domen heterochromatyny.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne dane SMLM w trzech kolorach z zminimalizowanym przesłuchem, co umożliwia wiarygodną ocenę efektów związków w obrębie celów jądrowych.
- Analityka: Generuje pomiary odległości między celami, lokalne mapy gęstości oraz wspólne profile gęstości na podstawie danych z lokalizacji w celu ilościowego określenia relacji przestrzennych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia dotyczące nanoskalowej organizacji chromatyny z ciągłością przedkliniczną poprzez zestandaryzowane, mierzalne odczyty przestrzenne.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku, zestandaryzowany protokół obrazowania jądrowego wielu celów, który można zastosować w programach odkrywczych skoncentrowanych na chromatynie.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów epigenetycznych poprzez bezpośrednie mapowanie przestrzenne komponentów i regulatorów chromatyny w skali nanometrycznej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i wierność sygnału w multipleksowej metodzie SMLM jądra komórkowego dzięki zoptymalizowanemu blokowaniu, walidacji przeciwciał i składom buforów.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w programach celowania epigenetycznego, dostarczając kontekstu przestrzennego, który pozwala przewidzieć funkcjonalne zaangażowanie celu i modulację szlaków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów epigenetycznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną lokalizację w chromatynie oraz koafinitet z kluczowymi elementami regulacyjnymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii superrozdzielczej, immunobarwienia oraz analizy chmur punktów w celu dokładnej interpretacji danych.
- Zależne od instrumentacji umożliwiającej SMLM oraz wyboru stabilnych fluoroforów kompatybilnych z sekwencyjnym znakowaniem i warunkami buforowania.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji walidacji przeciwciał, wydajności blokowania oraz protokołów wygaszania w celu zminimalizowania zmienności między partiami.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji do różnych celów chromatynowych, w tym dostępności epitopów i penetracji przeciwciał w utrwalonych, gęstych jądrach.
- Ograniczone przez sekwencyjny charakter barwienia, co wydłuża całkowity czas protokołu i wymaga starnej optymalizacji, aby zapobiec utracie celu lub degradacji sygnału w wielu rundach.
