Mikromechaniczna charakterystyka tkanki płucnej z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii siłowej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest charakterystyka lokalnego środowiska mechanicznego miąższu płuca w skali przestrzennej istotnej dla komórek rezydentnych poprzez bezpośredni pomiar lokalnych właściwości sprężystych świeżej tkanki płucnej z wykorzystaniem mikroindentacji za pomocą mikroskopii sił atomowych. Cel ten osiąga się poprzez wycięcie z agarowo-napowietrzonej tkanki płuca myszy za pomocą żyletki lub ostrza skalpela pasków miąższu płuca o długości i szerokości 5x5 mm oraz grubości 400 µm. Następnie nieutrwalone, nieprzepuszczone paski tkanki płucnej poddaje się barwieniu immunologicznemu, co pozwala na zidentyfikowanie obszarów zainteresowania dla mikroindentacji AFM.

Następnie przeprowadzono mikroindentację FM na paskach tkanki w PBS w temperaturze pokojowej. W celu bezpośredniego pomiaru lokalnych właściwości sprężystych świeżej tkanki płucnej uzyskano wyniki, które wykazują wyraźne różnice w zakresie i rozkładzie sztywności tkanki w normalnym i włóknistym miąższu płuca oraz duże wariacje przestrzenne sztywności, szczególnie w próbce płuca z włóknieniem.

Na podstawie map sztywności wyekstrahowanych z krzywych wymuszonego przemieszczenia, uzyskanych przy użyciu mikroindentacji FM. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi pomiarami, takimi jak rozciąganie pasków tkanki, jest zapewnienie bezprecedensowej rozdzielczości przestrzennej, co daje unikalny wgląd w zmienność sztywności tkanki w skali mikro. Pomiar ten może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak sposób, w jaki sztywność zmienia się przestrzennie w obrębie tkanki, oraz jaki jest zakres i skala przestrzenna zmian sztywności w przebiegu choroby.

Procesy prowadzące do przebudowy tkanki. Aby przygotować paski tkanki płucnej, należy rozpocząć od stabilizacji struktury płuc w celu umożliwienia cięcia poprzez nadmuchanie wyizolowanych płuc myszy. Wprowadzić dotrachealnie 50 mililitrów na kilogram masy ciała ciepłego, 2% agarozy o niskiej temperaturze żelowania przygotowanej w PBS, zawiązać tchawicę i chłodzić nadmuchane płuca w kąpieli z PBS w temperaturze czterech stopni Celsius przez 60 minut. Agaroza zgeliuje i stwardnieje w przestrzeniach powietrznych, delikatnie stabilizując strukturę płuc. W tym czasie, używając żyletki lub skalpela, pociąć ustabilizowaną agarozą tkankę płucną myszy na paski o długości i szerokości około pięciu na pięć milimetrów oraz grubości 400 mikrometrów.

Następnie płucz paski w PBS w temperaturze 37°C przez pięć minut, aby usunąć pozostałości aros i wykluczyć duże drogi oddechowe oraz naczynia. Wytnij paski z obszarów podplewralnych oddalonych od głównych oskrzeli; jeśli obrazowanie ma obejmować drogi oddechowe lub duże naczynia, wytnij paski z tkanki płucnej położonej bardziej proksymalnie względem głównych oskrzeli, aby wyizolować obszary zainteresowania do mikroindentacji FM. Zwizualizuj tkankę za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej lub przeprowadź immunobarwienie i zwizualizuj za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Procedurę opisano w części pisemnej niniejszego protokołu. Bezpośrednio przed charakterystyką FM przymocuj paski tkanki do szkiełek nakrywek o średnicy 15 milimetrów pokrytych poli-L-lizyną, podnosząc szkiełko od spodu pod pływającą tkanką i upewniając się, że pasek tkanki równomiernie rozłożył się na powierzchni szkiełka. W razie potrzeby przyciśnij pasek drugą, czystą, niepowlekaną szkiełkiem nakryvką, wywierając lekki nacisk, aby wspomóc przyleganie tkanki do szkiełka pokrytego poli-L-lizyną.

Przed każdą serią eksperymentów z mikroindentacją należy skalibrować system AFM zgodnie z instrukcjami producenta. W tym celu należy wyznaczyć dwa krytyczne parametry: stałą sprężystości wspornika przy użyciu metody fluktuacji termicznych w powietrzu oraz czułość ugięcia wspornika, która jest parametrem służącym do przeskalowania sygnału wyjściowego fotodiody na rzeczywistą odległość ugięcia wspornika.

Kalibruj czułość ugięcia, uzyskując standardową krzywą wymuszonego przemieszczenia w PBS na czystym szkiełku przedmiotowym. Następnie oblicz nachylenie krzywej wymuszonego przemieszczenia podczas pomiaru krzywej wymuszonego przemieszczenia. Końcówka A FM jest wysuwana w stronę powierzchni próbki i cofana z niej w jednym punkcie, podczas gdy ugięcie wspornika delta D jest monitorowane jako funkcja przemieszczenia końcówki delta Z. Zaleca się stosowanie trójkątnego wspornika z azotku krzemu z borokrzemianową końcówką sferyczną o średnicy 5 µm, używając sond FM o stałej sprężystości 0,06 N/m.

Przeprowadziliśmy charakterystykę mechaniczną materiałów miękkich o module ścinania w zakresie od 100 do 50 000 pascals. Przetrzyj dolną powierzchnię szkiełka nakrywkowego próbki chusteczką, a następnie przymocuj je do standardnego szkiełka przedmiotowego za pomocą smaru próżniowego. Umieść szkiełko przedmiotowe na stoliku próbkowym AFM i zalej powierzchnię 500 microliters PBS o temperaturze pokojowej.

Następnie umieść głowicę skanującą AFM nad próbką. Dostosuj stolik mikroskopu, ustawiając go do obserwacji przez okular, aby wycentrować końcówkę AFM w polu widzenia. Przesuń stolik AFM, aby wybrać interesujący obszar na tkance.

Następnie przełącz widok na kamerę CCD, aby zarejestrować obraz w kontraście fazowym i/lub obrazy fluorescencyjne tkanki, zależnie od potrzeb. Powoli przesuń końcówkę AFM w dół, aż do precyzyjnego kontaktu z próbką. Charakterystyka miękkich próbek metodą mikroindentacji AFM wymaga niewielkich głębokości wciskania, aby uniknąć dużych lokalnych odkształceń, które unieważniają model Hertza stosowany do obliczania modułu sprężystości; aby uniknąć dużych odkształceń, wykonaj indentację w trybie wyzwalania (trigger mode), ustawiając maksymalne ugięcie dźwigni na 500 nanometrów.

Ten limit ugięcia ograniczy maksymalną siłę wciśnięcia do wartości poniżej 30 nN. Prędkość wciśnięcia powinna zostać dobrana tak, aby była wystarczająco niska, by zbadać właściwości sprężyste, a nie wiskoelastyczne miękkiej próbki. W przypadku tkanki płuca do pojedynczego pomiaru z obszaru zainteresowania należy wybrać zakres prędkości od 2 do 20 µm/s.

Przesuń sondę AFM w miejsce zainteresowania i wykonaj pojedyncze wgniecenie, aby zebrać standardową krzywą siła-przemieszczenie. Sonda będzie poruszać się wyłącznie w kierunku Z. W celu zautomatyzowanego mapowania obszaru zainteresowania przełącz urządzenie w tryb mapowania sił, a następnie wybierz rozmiar skanowania oraz punkty próbkowania w obrębie wybranego obszaru.

Grot AFM przemieszcza się po powierzchni próbki pomiędzy ruchami wbijania i zbiera poszczególne krzywe przemieszczenia wymuszonego w każdym punkcie w obrębie zdefiniowanej siatki próbki. Uznaliśmy za praktyczne zastosowanie siatki próbki o wymiarach 16 na 16 w celu zmapowania obszaru o wymiarach 80 µm na 80 µm przy prędkości wbijania 20 µm/s, co można zrealizować w ciągu około 10 minut. Aby obliczyć moduł Younga, dopasowano krzywą przemieszczenia wymuszonego do modelu sferycznego wbijania Hertza, stosując nieliniowe dopasowanie krzywej metodą najmniejszych kwadratów, jak pokazano tutaj, gdzie F equals K sub C times delta D jest siłą ugięcia wspornika.

K sub C to stała sprężystości wspornika. R to promień sferycznej końcówki, delta równa delta Z minus delta D to wgłębienie, a nu to współczynnik Poissona próbki, który dla tkanki płuc wynosi 0,4. Aby ocenić jakość dopasowania, oblicz wartość SSR, czyli sumę kwadratów różnic między danymi a wartościami dopasowania podczas nieliniowego dopasowania krzywej.

Wyeliminuj niewiarygodne lub nieinterpretowalne pomiary, odrzucając dane z błędnych krzywych o dużych wartościach SSR. Jeśli jest to wymagane, przelicz moduł sprężystości E na moduł ścinania G, korzystając z zależności E równa się dwa razy suma jednego plus nu razy G. Aby zwizualizować przestrzenne wzorce sztywności zebrane w trybie mapowania sił, wykreśl dane modułu i mapy konturowe, na przykład w siatce 16 na 16 obejmującej obszar 80 µm na 80 µm.

Aby przetworzyć dużą ilość danych z krzywych siły, można napisać niestandardowy algorytm do automatycznego dopasowywania krzywych przemieszczenia siły, wyodrębniania modułów i/lub wykreślania map konturowych lub grafów ELA. Stosując te same procedury i parametry, które opisano powyżej, niniejszy rysunek pokazuje, że tkanka została prawidłowo pocięta i zabarwiona. Mikrostruktura pęcherzykowa miąższu płuc jest dobrze zachowana, co zaobserwowano podczas barwienia immunofluorescencyjnego na lamininę, składnik błony podstawnej, bez utrwalania i permeabilizacji.

Panele te przedstawiają barwienie immunofluorescencyjne kolagenu w świeżych, niefiksowanych płucach pobranych od myszy uprzednio traktowanych PBS lub bleomycyną w celu wywołania włóknienia. Przedstawiono tutaj przykładowe wykresy przemieszczenia w funkcji siły uzyskane za pomocą mikroindentacji AFM przy zastosowaniu tej samej siły. Końcówka AFM powoduje duże wgniecenie w miękkim obszarze, co skutkuje stosunkowo płaską krzywą przemieszczenia w funkcji siły (zaznaczoną na niebiesko), w przeciwieństwie do niewielkiego wgniecenia i stromej krzywej przemieszczenia w funkcji siły dla obszaru sztywniejszego (zaznaczonego na czerwono).

Aby uzyskać czyste krzywe siły po każdym wciśnięciu, końcówka AFM musi zostać całkowicie wycofana z powierzchni próbki i znajdować się poza kontaktem przed kolejnym wciśnięciem. Ten stan braku kontaktu odpowiada płaskiemu obszarowi krzywej, w którym końcówka przemieszcza się bez ugięcia wspornika. Rycina ta przedstawia typową fałszywą krzywą bez obszaru płaskiego, co zdarza się, gdy końcówka nie zostanie całkowicie wycofana z powierzchni próbki, na przykład gdy miękka próbka przykleja się do końcówki, co uniemożliwia określenie punktu kontaktu, jeśli końcówka zostanie całkowicie uwięziona w miękkiej próbce.

Krzywa może wyglądać w ten sposób, bez wyraźnego odchylenia, lecz z niewielkim szumem. Rysunek ten przedstawia sztywność. Dane wyekstrahowane z krzywych wymuszonego przemieszczenia, wyświetlone przestrzennie jako mapy sztywności określane jako ELAs graft, gdzie kolor skaluje się wraz ze sztywnością ELAs graft, wykazują uderzające różnice w zakresie i rozkładzie sztywności tkanki w normalnym i zwłókniałym miąższu płuc oraz duże wahania przestrzenne sztywności, szczególnie w próbce zwłókniałego płuca.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak charakteryzować lokalne środowisko mechaniczne miąższu płuc poprzez bezpośredni pomiar lokalnych właściwości elastycznych świeżej tkanki płucnej przy użyciu mikroskopii sił atomowych.