Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny
2 lutego 2024
Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.
Nasze badania koncentrują się na integrynie neutrofilowej. W tym badaniu mamy na celu ustalenie metody znalezienia małocząsteczkowych antagonistów aktywacji integryny beta dw. Wierzymy, że dzięki tej metodzie możemy znaleźć nowych antagonistów, którzy mogą pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, a także zapewnić wgląd translacyjny w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.
W przyszłości skupimy się na odkrywaniu nowych leków przeciwzapalnych i analizowaniu mechanizmów ich działania. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż cztery mililitry heparynizowanej krwi ludzkiej na ośmiu mililitrach pożywki o gradiencie gęstości w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować krew o stężeniu 550 G przez 30 do 50 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć górną warstwę zawierającą osocze i komórki jednojądrzaste. Zebrać neutrofile z dolnego pasma mętnego i około trzech do czterech mililitrów poniżej klarownej cieczy do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów PBS. Delikatnie odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać zawiesinę neutrofili.
Odwirować zawiesinę neutrofili o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant z probówki i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Ponownie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Po usunięciu supernatantu należy użyć ssania próżniowego, aby usunąć resztki supernatantu na ściance probówki i wokół ujścia probówki. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki neutrofilowej. Połącz jeden mililitr 1,2 mikrograma na mililitr roztworu przeciwciała z 0,2 mililitra pożywki neutrofilowej w 1,5 mililitrowej probówce.
Dodaj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciała do studzienek kontroli ujemnej w płytce 384-dołkowej. W 15-mililitrowej probówce połącz dziewięć mililitrów roztworu przeciwciała, 21,6 mikrolitrów roztworu FMLP i 1,7784 mililitra pożywki neutrofilowej. Dodać 25 mikrolitrów tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej.
Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś pięć mikrolitrów roztworu związku z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową. Odwirować zawiesinę o sile 500 G przez jedną minutę. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny neutrofili do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety.
Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez 10 minut. Następnie, aby utrwalić komórki, dodaj trzy mikrolitry 16% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Po włączeniu cytometru przepływowego załadować 384-dołkową płytkę zawierającą zawiesinę neutrofili poddanych działaniu związku na uchwyt próbki.
Otwórz oprogramowanie. Zainicjuj nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory.
Następnie kliknij ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki i kliknij próbkę. Włącz przełącznik wysokiej przepustowości, a następnie w panelu szybkości wybierz opcję wysoka. W polu woluminu wprowadź wartość 50.
Wybrać próbki w kolumnach o numerach nieparzystych i aktywować przełącznik mieszania. Na koniec nazwij próbki w prawym panelu. Średnie wartości intensywności fluorescencji badanych związków znajdowały się powyżej linii odcięcia, co wskazuje, że żaden ze związków nie został zidentyfikowany jako antagoniści integryny beta dwa.
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza wysokoprzepustową metodę przesiewową opartą na cytometrii przepłyewej w celu zidentyfikowania małocząsteczkowych leków hamujących aktywację integryny 尾2 na ludzkich neutrofilach. Metoda ta ma na celu odkrycie nowych antagonistów, które mogłyby pogłębić zrozumienie fizjologii integryn i dostarczyć informacji przydatnych w opracowywaniu przeciwzapalnych terapii opartych na integrynach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- immunologia
- farmakologia
Wprowadzenie
- Neutrofile odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- Integrina β2 jest niezbędna dla aktywacji i funkcji neutrofili.
- Identyfikacja antagonistów może prowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych.
- Obecne metody przesiewania małych cząsteczek są ograniczone.
Cel badania
- Opracowanie metody wysokoprzepustowego przesiewu antagonistów integryny β2.
- Pogłębienie wiedzy na temat fizjologii integryn.
- Dostarczenie informacji przydatnych przy opracowywaniu leków przeciwzapalnych.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Izolacja neutrofili ludzkich z krwi z heparyną.
- Wirowanie w celu rozdzielenia składników krwi.
- Ocena poziomów aktywacji integryny 尾2.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja inhibitorów małocząsteczkowych.
- Wykazano skuteczność metody przesiewowej.
- Dostarczono nowych informacji na temat mechanizmów aktywacji integryn.
- Potencjał dla przyszłego rozwoju leków w terapiach przeciwzapalnych.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w przesiewaniu antagonistów integryny 尾2.
- Wyniki mogą doprowadzić do postępów w terapiach przeciwzapalnych.
- Wymagane są dalsze badania w celu zgłębienia mechanizmów działania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowy screening związków hamujących integryny za pomocą cytometrii przepływowej umożliwia szybką identyfikację małych cząsteczek modulujących aktywację neutrofili, co stanowi kluczowy punkt zwrotny w badaniach nad chorobami zapalnymi. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów terapeutycznych i przyspiesza wczesny etap selekcji portfela w procesie poszukiwania leków przeciwzapalnych. Integracja przeciwciał raportujących zmiany konformacyjne z zautomatyzowanymi platformami cytometrycznymi zwiększa ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów aktywacji integryn w pierwotnych ludzkich neutrofilach.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu z wykorzystaniem odczytów przeciwciał specyficznych dla konformacji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie związków działających na integryny od tych wpływających na sygnalizację powyżej w kaskadzie.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wyborze kandydatów na leki przeciwzapalne do dalszych badań.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane, ilościowe wyniki odpowiednie do wysokoprzepustowej oceny związków.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne dla skalowalnych procesów przesiewowych.
- Umożliwia powtarzalną ocenę bibliotek związków w formacie płytek 384-dołkowych.
- Wspiera ponowne wykorzystanie platformy w innych wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych opartych na przeciwciałach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z biologią neutrofili istotną dla chorób uwikłanych w patologie zapalne.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkryć po przedkliniczne badania mechanizmu działania.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o postępach prac z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ilościowych profili inhibicji.
- Wspiera rozwój translacyjnych biomarkerów dla terapii celowanych w integryny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta wysokoprzepustowa metoda przesiewania stanowi pomost między wczesną fazą odkrywania a identyfikacją związków wiodących, zapewniając niezawodny schemat postępowania w celu oceny związków ukierunkowanych na integryny w pierwotnych komórkach odpornościowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa stan aktywacji integryn w celu wyjaśnienia zaangażowania szlaku sygnałowego i istotności biologicznej.
- Przesiewanie: Oferuje powtarzalne, skalowalne wyniki analizy do segregacji związków i walidacji trafień.
- Analityka: Generuje dane dotyczące średniej intensywności fluorescencji do statystycznego porównania efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Łączy dane o inhibicji in vitro z funkcją neutrofili istotną w przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi szablon adaptacji wysokoprzepustowych przesiewów opartych na przeciwciałach do innych celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczo
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie wiązania celu i inhibicji funkcjonalnej.
- Wartość operacyjna: Usprawnia standaryzację testów, powtarzalność oraz skalowalność wysokoprzepustową.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki przeciwzapalne z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie cytometrii przepływowej oraz detekcji z wykorzystaniem przeciwciał.
- Konieczny jest dostęp do wysokoprzepustowych platform cytometrycznych oraz zautomatyzowanych systemów dozowania cieczy.
- Wymagana jest rygorystyczna standaryzacja testów między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Może być konieczna adaptacja metody dla różnych podtypów integryn lub modeli komórkowych.
- Metoda jest zależna od dostępności przeciwciał specyficznych dla konformacji oraz zwalidowanych kontroli.
