Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy
16 grudnia 2022
Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.
Aby uzyskać lepszy wgląd w skład i strukturę splotu naczyniówkowego, pierwszą nieocenioną metodą jest skuteczna metoda izolowania splotu naczyniówkowego z komór mózgowych. Dzięki tej technice mikrodysekcji możliwe jest wypreparowanie splotu naczyniówkowego z komór mózgu, zachowując jego funkcję, żywotność i strukturę bez zanieczyszczania splotu naczyniówkowego otaczającą tkanką. Istotną przeszkodą w izolacji splotu naczyniówkowego jest zidentyfikowanie struktury, która nadal unosi się w komorach mózgu.
Zabarwienie splotu naczyniówkowego błękitem bromofenolowym ułatwia izolację. Procedurę zademonstruje Elien Van Wonterghem, kierownik naszego laboratorium. Zacznij od przygotowania końcowego środka znieczulającego, roztworu perfuzyjnego przezsercowego oraz roztworu wymaganego do skaningowej mikroskopii elektronowej lub SEM oraz innych roztworów, jak wspomniano w tekście.
Aby wyizolować mózg myszy, umieść nieuleczalnie znieczulone zwierzę w grzbietowej pozycji odleżynowej i unieruchamiaj mysz, przypinając kończyny do płytki. Zdezynfekuj klatkę piersiową, rozpylając 70% etanolu, a następnie wykonaj nacięcie o długości około czterech centymetrów tuż pod przeponą za pomocą ostrza chirurgicznego ze stali węglowej. Otwórz skórę i odsłoń klatkę piersiową za pomocą nożyczek chirurgicznych.
Całkowicie rozetnij przeponę i oddziel klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i bijące serce. Za pomocą pompy perfuzyjnej przekrwić skórę przezskórnie 10 mililitrami roztworu perfuzyjnego z szybkością 4,5 mililitra na minutę. Wprowadzić igłę o rozmiarze 26 G do lewej komory, aby przepompować roztwór do obwodu ogólnoustrojowego.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij prawe przedsionek, aby krew wydostała się z krążenia. Po ścięciu głowy myszy rozcięto skórę głowy, wykonując nacięcie zaczynające się między uszami do górnego nad oczami. Pociągnij skórę na boki, aby odsłonić czaszkę.
Następnie rozetnij czaszkę, podążając za szwami łuskowymi w kierunku części nosowej. Po zakończeniu umieść mózg na lodowatej szalce Petriego i dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do tkanki mózgowej. Aby wyizolować splot naczyniówkowy unoszący się w czwartej komorze, delikatnie odetnij móżdżek od mózgu za pomocą skalpela.
Usuń pozostałe części tkanki pnia mózgu z móżdżku. Obróć mózg tak, aby linia cięcia była skierowana do góry, upewniając się, że jama czwartej komory jest widoczna pośrodku odcinka ze splotem naczyniówkowym leżącym w miejscu grzbietowym. W razie potrzeby otwórz komorę, ciągnąc tkankę łączną ostrymi kleszczami.
Delikatnie oderwij splot naczyniówkowy od ściany komory za pomocą maleńkich ostrych kleszczy. Aby odizolować splot naczyniówkowy od komory bocznej, strzałkowo przeciął mózg na dwie półkule za pomocą maleńkich ostrych kleszczy. Obróć jedną półkulę mózgu tak, aby linia cięcia była skierowana do góry.
Aby odsłonić komorę boczną, delikatnie odciągnij korę od wzgórza. Cofnij hipokamp do środkowej strzałkowej linii cięcia. Komora boczna jest teraz widoczna, a splot naczyniówkowy leży na dnie komory.
W razie potrzeby otwórz nieco komorę, rozciągając tkankę łączną ostrymi kleszczami. Użyj maleńkich ostrych kleszczy, aby delikatnie oderwać splot naczyniówkowy od ściany komory. Aby przygotować próbkę do SEM, przenieś świeżo wyizolowany splot naczyniówkowy do świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po zakończeniu przemyj próbkę trzy razy, używając od trzech do pięciu mililitrów 0,1-molowego buforu kakodylanu sodu przez pięć minut każdy. Umieść próbki w trzech do pięciu mililitrach 2% tetratlenku osmu w 0,1-molowym buforze kakodylanu sodu przez 30 minut. Następnie umyj próbki trzy razy przez pięć minut każda, używając od trzech do pięciu mililitrów ultraczystej wody.
Następnie odwodnić próbki w rosnącej serii lodowatych stężeń alkoholu etylowego w ciągu 15 minut na roztwór alkoholu etylowego. Użyj osuszacza w punkcie krytycznym, aby prawidłowo wysuszyć próbkę. Ostrożnie umieść próbkę na mocowaniu próbki za pomocą naklejki węglowej i zwizualizuj próbki splotu naczyniówkowego za pomocą SEM.
Prezentowany protokół umożliwił skuteczną izolację splotu naczyniówkowego od komory bocznej i czwartej mózgu myszy. Perfuzja z błękitem bromofenolowym spowodowała uwidocznienie splotu naczyniówkowego. Gdy błękit bromofenolowy nie był dopuszczony do dalszych etapów przetwarzania, perfuzja z PBS-heparyną lub nie przeprowadzano perfuzji w celu przetworzenia.
Analiza morfologiczna SEM powierzchni komórek nabłonka splotu naczyniówkowego (CPE) wyraźnie pokazuje dwuramienną strukturę czwartej komory i typową formę w kształcie litery C bocznego splotu naczyniówkowego odizolowanego od komory bocznej. Większe powiększenie SEM ujawniło struktury przypominające pęcherzyki po stronie wierzchołkowej komórek CPE i mikrokosmków, co wskazuje, że zmiany morfologiczne komórek CPE w warunkach chorobowych można badać za pomocą SEM. Ważne jest, aby dotykać i wyjmować tylko tkankę splotu naczyniówkowego, aby nie zanieczyścić próbki otaczającą tkanką.
Zachowaj niezbędną ostrożność, aby zachować strukturę splotu naczyniówkowego. Na izolowanym splocie naczyniówkowym można zastosować różne dalsze techniki w celu zbadania jego struktury i funkcji, począwszy od analizy mikroskopowej, poprzez analizę transkryptomu, aż po cytometrię przepływową. Mikropreparacja splotu naczyniówkowego z mózgu pozwala nam uzyskać lepszy wgląd w strukturę i funkcję tej maleńkiej tkanki mózgowej.
Wiedza ta jest niezbędna, aby lepiej zrozumieć jego rolę w chorobach neurologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje technikę mikrosekcji służącą do izolacji splotów naczyniowych (CP) z komór mózgu myszy, a także wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) do badania ich struktury komórkowej. Zrozumienie architektury i funkcji splotów naczyniowych jest kluczowe w neuronauce, w szczególności w odniesieniu do ich roli w zdrowiu i chorobach ośrodkowego układu nerwowego.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neuroanatomia
- Biologia komórki
Wstęp
- Splot naczyniowy jest istotną, lecz wciąż niewystarczająco zbadaną tkanką.
- Odgrywa on krytyczną rolę w zachowaniu zdrowia oraz w patologii ośrodkowego układu nerwowego.
- Efektywna izolacja i charakterystyka splotu naczyniowego mają istotne znaczenie dla zrozumienia chorób neurologicznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody izolacji splotów naczyniowych z komór mózgu myszy.
- Zbadanie struktury komórkowej splotów naczyniowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
- Zachowanie żywotności i integralności splotów naczyniowych podczas procesu izolacji.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano techniki mikrodysekcji w celu wyizolowania splotu naczyniowego.
- W procesie izolacji wykorzystano modele mysie, koncentrując się szczególnie na komorze czwartej i bocznych.
- Metodyka obejmuje anestezję terminalną, procedury chirurgiczne oraz fiksację do analizy SEM.
- Kluczowe etapy obejmują zastosowanie barwienia błękitem bromofenolowym w celu lepszej wizualizacji oraz staranną manipulację w celu uniknięcia kontaminacji.
Główne wyniki
- Protokół pozwolił na skuteczną izolację splotu naczyniówkowego, umożliwiając analizę morfologiczną za pomocą SEM.
- Obserwacje ujawniły wyraźne cechy strukturalne komórek nabłonkowych splotu naczyniówkowego, w tym mikrokosmki i struktury przypominające pęcherzyki.
- Wyniki te pozwalają na przeprowadzenie dalszych badań nad zmianami związanymi z chorobami na poziomie komórkowym.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia usprawnione podejście do izolacji splotu naczyniówkowego w celu szczegółowej analizy strukturalnej.
- Uzyskane informacje mogą pogłębić zrozumienie roli splotu naczyniówkowego w zdrowiu i chorobach neurologicznych.
- Podsumowując, metoda ta umożliwia znaczący postęp w badaniach nad tym kluczowym, choć często pomijanym elementem mózgu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajna mikrodyssekcja oraz obrazowanie za pomocą SEM splotu naczyniówkowego (CP) myszy umożliwiają wysokiej wierności analizę strukturalną i funkcjonalną tego kluczowego interfejsu OUN. Ten schemat postępowania wspiera wczesne etapy odkryć, dostarczając niezanieczyszczoną, żywotną tkankę CP do dalszych badań molekularnych i morfologicznych, co ma bezpośredni wpływ na walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach neurobiologicznych. Niezawodna izolacja CP stanowi podstawę ciągłości translacyjnej dla modeli chorób OUN oraz poszukiwania biomarkerów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę struktury i funkcji CP w celu walidacji celów w badaniach nad OUN.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zachowanie żywotności tkanki i minimalizację zanieczyszczeń.
- Zwiększa pewność prognostyczną wczesnych hipotez neurobiologicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowaną tkankę CP do ilościowych analiz następczych, w tym transkryptomiki i proteomiki.
- Gwarantuje powtarzalność i standaryzację poprzez zachowanie integralności strukturalnej podczas izolacji.
- Przygotowuje próbki odpowiednie do obrazowania o wysokiej rozdzielczości oraz skalowalnych procesów analitycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia badanie istotnych dla choroby zmian morfologicznych w komórkach nabłonkowych CP przy użyciu SEM.
- Wspiera dostosowanie modeli przedklinicznych do mechanizmów chorób OUN u ludzi.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie wyników strukturalnych z efektami funkcjonalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół mikrodysekcji i SEM integruje etap wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, dostarczając podstawowe próbki tkanek do analiz molekularnych, komórkowych oraz obrazowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację niezanieczyszczonej tkanki CP.
- Przesiewanie: Dostarcza próbek gotowych do analizy, zapewniając powtarzalne pomiary ilościowe.
- Analityka: Umożliwia wysokorozdzielcze odczyty morfologiczne oraz analizę porównawczą warunków.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając badania strukturalne istotne dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Ustanawia zstandaryzowany protokół, który można dostosować do różnych programów badawczych nad OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Sprzyja powtarzalności, standaryzacji i skalowalności w procesach przygotowywania tkanek.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu generowania solidnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i modeli OUN w oparciu o analizę ryzyka.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w mikrodysekcji i przygotowywaniu próbek do SEM.
- Niezbędny jest dostęp do sprzętu do perfuzji, odczynników utrwalających i infrastruktury mikroskopii elektronowej.
- Wymagana jest ścisła standaryzacja między zespołami, aby uniknąć kontaminacji tkanek.
- Metoda jest adaptowalna do innych gatunków poprzez odpowiednie modyfikacje protokołu.
- Niezbędna jest ostrożność w obchodzeniu się z próbkami w celu zachowania struktury CP oraz jakości późniejszych analiz.
Częste pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
