Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

Liczenie komórek zarodników Bacillus subtilis przy użyciu tradycyjnych metod może być pracochłonnym zadaniem, ponieważ metody te mogą być całkowicie ręczne, a ich dokładność zależy od doświadczenia operatora. Protokół ten umożliwia liczenie uśpionych i kiełkujących zarodników. Ponadto technika ta umożliwia również określenie procentowego stopnia radzenia sobie białek fluorescencyjnych na jej powierzchni.

Biorąc pod uwagę etap konfiguracji obecny w tym protokole, wizja demonstruje się z udogodnieniami i zrozumieniem technicznym oraz szczegółami opieki w tym wykonaniu. Zacznij od zalogowania się do oprogramowania cytometru. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz Cytometr, a następnie Uruchamianie fluidyczne.

Następnie wybierz Tryby czyszczenia. I na koniec zainicjuj SIT Flush. Weź 50 mikrolitrów zarodników autoklawu i inkubuj je z bromkiem etydyny o współczynniku rozcieńczenia 0,05% objętości przez 30 minut, chroniąc przed światłem.

Przemyć zarodniki trzykrotnie PBS, odwirowując przy 17 949 G przez 10 minut i ponownie zawieszając w PBS. Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania i przeanalizuj próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Zdefiniować strategię bramkowania w oparciu o charakterystyki morfometryczne i fluorescencyjne cząstek, wykorzystując kontrolę ujemną jako punkt odniesienia.

Następnie delikatnie wymieszaj tubkę. Podłącz go do sondy cytometru przepływowego i kliknij przycisk Pobierz. Aby ustawić moc lasera należy przejść do zakładki parametry w oknie cytometru, dostosować rozproszenie do przodu na 375 i rozproszenie boczne na 275.

Następnie wybierz zakładkę próg i ustaw ją na 500. Następnie przeanalizuj bezbarwną próbkę zawierającą tylko zarodniki, aby wyeliminować autofluorescencję. W zakładce parametrów dostosuj napięcia detektora filtra trzeciego na 603 i napięcia detektora filtra piątego na 538, aby rozróżnić populacje ujemne i dodatnie za pomocą fluorescencji w kontrolach.

Następnie kliknij Kompensacja i ustaw przesunięcie ustawień detektora filtra 5 na 3 na jeden. Aby skonfigurować urządzenie do pozyskiwania, wybierz pozycję Eksperyment, wybierz układ eksperymentu i ustaw pozyskiwanie na 30 000 zdarzeń. Po dostosowaniu parametrów należy pozyskać dane dla próbek, które są oznaczone i zawierają kulki w cytometrze przepływowym.

Odwirować 50 mikrolitrów zarodników przy 17 949 G przez 10 minut. Następnie ponownie zawiesić zarodniki za pomocą 25 mikrolitrów 1-etylo-3-3-dimetyloaminopropylokarbodimidu i inkubować przez 15 minut. Następnie dodać 25 mikrolitrów N-hydroksysulfosukcynimidu o stężeniu 50 milimolów do zawiesiny zarodników.

Inkubować zawiesinę zarodników w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj zarodniki trzykrotnie PBS, odwirowując, jak pokazano wcześniej. Dodać białko fluorescencyjne do próbek i inkubować przez noc w temperaturze 15 stopni Celsjusza.

Dodać 10 miligramów na mililitr bromku etydyny rozcieńczonego w stosunku 1 do 50, a następnie pozostawić próbki na lodzie na godzinę, chroniąc przed światłem. Po umyciu zarodników i zdefiniowaniu bramek, jak pokazano wcześniej, zmień parametry dla detektora filtrującego trzy na osi x i detektora filtrującego pięć na osi Y wykresu punktowego. Metoda liczenia kulek wykryła dwa razy od 10 do trzeciej zarodników na mikrolitr w próbkach zarodników w autoklawie.

Barwienie bromkiem etydyny próbek zarodników autoklawu wykazało wyższą średnią intensywność fluorescencji niż barwienie zarodników nieautoklawowanych, co wskazuje na większe zabarwienie materiału genetycznego. Powierzchnia zarodników autoklawu, w połączeniu z przeciwciałem anty-ludzkiej interleukiny 10 znakowanym APC, wykazała większą skuteczność sprzężenia w porównaniu z zarodnikami nieautoklawizowanymi. Obecność zarodników przepuszczalnych dla bromku etydyny wskazywała na możliwą obecność kiełkujących zarodników w całej populacji.

Na podstawie analiz cytometrii przepływowej zaobserwowano, że przeciwciało fluorescencyjne wykazywało wyższy procent sprzęgania z uśpionymi zarodnikami w porównaniu z przeciwciałami kiełkującymi. Ponadto wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał fluorescencyjnych zaobserwowano wzrost odsetka sprzężonych zarodników i średniej intensywności fluorescencji. Ważne jest, aby przeprowadzić dokładną homogenizację obecnych kulek, aby zapewnić precyzyjne odczyty za pomocą cytometrii przepływowej i dokładne wyliczenie zarodników.

Standaryzacja stężenia antygenów przyłączonych do zarodników, kanadyjskie badania analizują zastosowanie zarodników jako przeciwciał szczepionkowych.