Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów
28 kwietnia 2023
Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.
Nasze badania koncentrują się na arbowirusach, owadach i interakcjach roślin. Pobieranie próbek hemolimfy od małych stawonogów stanowi wyzwanie techniczne dla badań nad chorobami przenoszonymi przez owady. Niniejszy protokół pokazuje naszą precyzyjną i wymierną technikę przeciwdziałania temu problemowi.
Ostatnie osiągnięcia badawcze w zakresie przenoszenia arbowirusów wykazały, że wirusy mogą manipulować kilkoma ważnymi czynnikami wektorowymi, aby przebić się przez barierę gospodarza. Protokół ten jest prostą, opłacalną i cenną techniką, która pozwala na precyzyjne określenie ilościowe hemolimfy. Metoda ta oferuje również cenną technologię do badania interakcji między wirusami a wektorami.
Nasze nadchodzące badania będą koncentrować się na zrozumieniu mechanizmów molekularnych różnych transmisji przez owady wektorowe. Badamy i ulepszamy nowe techniki operacyjne. Do tego badania użyj małych brązowych skoczków roślinnych lub SBPH, hodowanych w sadzonkach ryżu.
Gdy kultury będą gotowe, umieść wyhodowane SBPH w probówce wirówkowej i umieść je w łaźni lodowej na 10 do 30 minut. Następnie umieść zamrożony SBPH na szklanym szkiełku pod mikroskopem stereoskopowym z brzuchem skierowanym do góry i dostosuj ostrość na jego sześciu nogach. Przygotuj dwie precyzyjne pęsety z bardzo cienkimi końcówkami.
Za pomocą jednej pęsety dociśnij ciało owada, aby utrzymać je na miejscu, i ostrożnie ściągnij jedną nogę drugą pęsetą. Następnie delikatnie przyciśnij klatkę piersiową owada, pozwalając hemolimfie przepłynąć przez ranę. Aby pobrać hemolimfę, przygotuj mikropipetę, umieszczając jednomikrolitrową rurkę kapilarną w bańce pipety.
Umieść rurkę kapilarną blisko rany owada, trzymając za gruszkę pipety do mikropipet. Przyłóż końcówkę kapilary do wydzielającej się hemolimfy i zbierz ją. Gdy rurka kapilarna osiągnie żądaną linię skali, lekko zablokuj palcem mały otwór w bańce pipety, aby zatrzymać proces wchłaniania.
Następnie zebraną hemolimfę rozładować do 100 mikrolitrów buforu PBS. Dokładność pobierania hemolimfy została potwierdzona za pomocą SDS-PAGE, która wykazała podobną zawartość białka we wszystkich trzech próbkach hemolimfy pobranych osobno. W przypadku larw całkowite stężenie białka wynosiło około 3,7 miligrama na mililitr.
U dorosłych samic i mężczyzn SBPH stężenia białka wynosiły odpowiednio około 3,5 i 3,6 miligrama na mililitr, nie wykazując istotnej różnicy między trzema próbkami. Larwa hemolimfy wykazywała hemocyty o wielkości od 2 do 20 nanometrów. Ponadto stężenie komórek było porównywalne w trzech pobranych próbkach hemolimfy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie podejmuje problem techniczny związany z pobieraniem mierzalnych ilości hemolimfy od małych stawonogów, a konkretnie od brązowych skoczków ryżowych (SBPH), w celu usprawnienia badań nad arbowirusami przenoszonymi przez owady. Opracowany protokół oferuje prostą i kosztowo efektywną metodę precyzyjnego pobierania hemolimfy, torując drogę do dalszych analiz oddziaływań między wirusem a wektorem.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Choroby przenoszone przez owady
- Interakcje wektor-wirus
- Analiza hemolimfy
Wstęp
- Arbowirusy mogą manipulować czynnikami wektora, aby przełamać bariery gospodarza.
- Badanie hemolimfy jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmów transmisji wirusów.
- Obecnie istnieją trudności w pozyskiwaniu hemolimfy z małych stawonogów.
Zastosowane metody
- Pobieranie hemolimfy z wykorzystaniem specjalistycznej techniki mikropipetowania.
- Organizm modelowy: brunatna cykadka ryżowa (SBPH).
- Techniki: SDS-PAGE w celu weryfikacji zawartości białek.
Główne wyniki
- Metoda pobierania hemolimfy pozwoliła na uzyskanie spójnych stężeń białek we wszystkich próbkach.
- Poziomy białek wynosiły około 3,7 mg/mL dla larw oraz 3,5-3,6 mg/mL dla osobników dorosłych.
- Rozmiary komórek hemolimfy mieściły się w zakresie od 2 do 20 nanometrów.
Wnioski
- Badanie pomyślnie demonstruje niezawodną metodę pobierania hemolimfy.
- Technika ta ma istotne znaczenie dla przyszłych badań biologicznych nad arbowirusami i ich wektorami.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ilościowe pobieranie hemolimfy od małych stawonogów rozwiązuje krytyczny problem w badaniach nad chorobami przenoszonymi przez wektory, umożliwiając precyzyjne badanie interakcji wirus-wektor. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnym etapie odkrywania oraz walidacji celów dla mechanizmów transmisji arbowirusów. Niezawodne pozyskiwanie próbek zapewnia ciągłość translacyjną od badań podstawowych do opracowywania modeli przedklinicznych w biologii wektorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie manipulacji czynnikami wektora przez wirusa na poziomie molekularnym.
- Wspiera walidację funkcjonalną kompetencji wektora oraz dróg transmisji.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez dostarczenie powtarzalnych, mierzalnych próbek do badań mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane próbki hemolimfy do późniejszych analiz biochemicznych i molekularnych.
- Poprawia powtarzalność testów oraz wyniki ilościowe w pomiarach stężenia białek i komórek.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie materiału biologicznego do badań przesiewowych interakcji wektor-wirus.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność z systemami istotnymi dla przebiegu choroby poprzez modelowanie naturalnych oddziaływań między wektorem a wirusem.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrycia do przedklinicznej walidacji interwencji celujących w wektor.
- Zmniejsza ryzyko przy wprowadzaniu kandydatów do dalszych faz badań poprzez zapewnienie spójności próbek i istotności biologicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda pobierania hemolimfy wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć po badania przedkliniczne w zakresie chorób przenoszonych przez wektory, wspierając zarówno badania mechanistyczne, jak i opracowywanie testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących kompetencji wektorowych i mechanizmów transmisji wirusa.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe próbki do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza spójnych pomiarów stężenia białek i komórek do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do systemów wektorowych istotnych dla danej choroby w badaniach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko stosowalny protokół dla różnorodnych modeli stawonogów w badaniach nad biologią wektorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad wektorami wirusowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pobieranie próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w różnych zespołach badawczych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz efektywnie kapitałowy rozwój programów ukierunkowanych na wektory.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów w fazie odkrywania i badań przedklinicznych w ramach programów rozwoju leków na choroby przenoszone przez wektory, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie postępowania z stawonogami i technik mikropróbkowania.
- Wymaga dostępu do stereomikroskopii oraz precyzyjnego instrumentarium do mikropipetowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójnej jakości próbek i porównywalności danych.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli małych stawonogów po optymalizacji protokołu.
- Wydajność i jakość próbek mogą różnić się w zależności od wielkości i stanu fizjologicznego stawonoga.
