Prosty protokół ekstrakcji hemocytów z dzikich gąsienic

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie, wizualizacja i policzenie hemocytów z dzikich gąsienic. Jest to realizowane poprzez uprzednie znieczulenie gąsienicy poprzez umieszczenie jej na lodzie, wstrzyknięcie roztworu buforowego zawierającego przeciwzakrzep oraz ponowne umieszczenie gąsienicy na lodzie, aby umożliwić hemocytom powrót do krążenia przed ekstrakcją. Drugim krokiem jest wykonanie płytkiego nacięcia na tylnym końcu gąsienicy za pomocą czystego skalpela.

Następnie gąsienicę delikatnie ściska się za pomocą miękkich pęsety. Potem mieszaninę hemolimfy z roztworem buforowym aspiruje się za pomocą mikropipety i zbiera do probówki do mikrocentryfugi. Ostatnim krokiem jest delikatne zmieszanie roztworu hemolimfy z równą objętością roztworu buforowego i przeniesienie 10 µL roztworu na hemocytometr w celu wizualizacji i zliczenia liczby hemocytów.

W rezultacie ta metoda ekstrakcji hemocytów może być wykorzystywana jako szybki i skuteczny sposób zliczania hemocytów u różnych gatunków gąsienic oraz służyć jako narzędzie do badania fizjologicznych aspektów komórkowej odpowiedzi odpornościowej owadów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość ekstrakcji hemolimfy z gąsienic o bardzo zredukowanym przełyku. Inne modele gąsienic są upuszczane poprzez odcięcie jednego z odnóży, a następnie ekstrakcję hemocytów z wypływającej cieczy.

Ponadto technikę tę można wykorzystać do pozyskiwania hemolimfy od innych gatunków owadów. Metoda ta może posłużyć do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekoimmunologii, takie jak wpływ jakości diety, stopnia rozwoju lub ekspozycji na różne patogeny na komórkową odpowiedź odpornościową owadów. Aby rozpocząć tę procedurę, znieczul larwy w przedostatnim stadium rozwojowym, chłodząc je na lodzie przez 20 minut przed ekstrakcją hemocytów.

Następnie wsuń tępy koniec czystej igły kapilarnej o rozmiarze 16 G do rurki połączonej z 20 mililitrową szklaną strzykawką. Pozostaw probówkę zawierającą roztwór zbierający na blacie laboratoryjnym. Powoli napełnij kapilarę około 10 do 15 µL buforu.

Następnie oprzyj igłę na kulce gliny umieszczonej obok mikroskopu stereoskopowego. Umieść gąsienicę w szalce Petriego. Owad powinien być ułożony na boku w taki sposób, aby sferule były wyraźnie widoczne.

Podczas obserwacji pod stereomikroskopem, unieruchom gąsienicę za pomocą pęsety i umieść igłę blisko jednego z segmentów sferycznych, gdzie kutykula owada jest zazwyczaj bardziej miękka. Następnie delikatnie dociśnij igłę kapilarną do ciała owada. Po przebiciu kutykuli wstrzyknij do gąsienicy całą objętość roztworu.

Ciało gąsienicy spuchnie po wstrzyknięciu, ale nie powinno pęknąć ani przeciekać. Umieść gąsienicę z powrotem w schłodzonej płytce Petriego. Ułóż owada grzbietem do góry, aby zapobiec wyciekowi buforu z miejsca wkłucia.

Powtórz iniekcje dla każdej gąsienicy wykorzystywanej do ekstrakcji hemolimfy. Następnie pozostaw wszystkie owady do schłodzenia na lodzie przez 30 minut. Teraz umieść gąsienicę w szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.

Uważnie wykonaj płytkie nacięcie o długości około dwóch do trzech milimetrów w tylnej części gąsienicy, używając sterylnego skalpela, tak aby nie uszkodzić jelit ani innych narządów wewnętrznych. Następnie delikatnie ściśnij gąsienicę za pomocą elastycznych plastikowych pęset, pobierając około 10 do 20 µL hemolimfy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 µL. Ponownie należy uważać, aby nie uszkodzić tkanek wewnętrznych.

Następnie usunąć szczątki gąsienic. Hemolimfę z każdej gąsienicy zebrać do osobnych, oznakowanych, silikonizowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mililitra. Następnie do każdej próbki hemolimfy pobranej od poszczególnych gąsienic dodać około 10 do 20 µL roztworu inkubacyjnego.

Na tym etapie próbki hemolimfy należy cały czas przechowywać w lodzie. Próbkę hemolimfy i roztwór inkubacyjny wymieszaj bezpośrednio przed zliczeniem hemocytów.

Obróbka ta pozwala na prawidłowe rozdzielenie hemocytów i zapobiega ich zlepianiu się. Za pomocą czystego końcówki do pipety przenieś 10 µL próbki hemolimfy zmieszanej z roztworem inkubacyjnym na hemocytometr. Następnie, używając mikroskopu złożonego, policz i zapisz liczbę hemocytów w co najmniej 15 dużych kwadratach centralnej siatki hemocytometru.

Zsumuj te wartości, aby uzyskać całkowitą liczbę hemocytów w 15 polach. Następnie dokładnie wypłucz hemocytometr oraz jego szkiełko nakrywkę, używając butelki z wodą destylowaną i dejonizowaną. Następnie wytrzyj je do sucha chusteczkami Kim wipes.

Powtórz procedury dla pozostałych próbek hemolimfy i oblicz średnią liczbę hemocytów na mililitr objętości hemolimfy dla każdej gąsienicy. Obraz z mikroskopii w świetle przechodzącym przedstawia wyizolowane hemocyty z gąsienic nucle hin ai przy 20-krotnym powiększeniu. Po przeprowadzeniu tej procedury zebrane hemocyty można wykorzystać do badania komórkowej odpowiedzi immunologicznej oraz do przeprowadzenia testów, takich jak fagocytoza, enkapsulacja oraz aktywność oksydazy pH.

Dodatkowo, niezużyte RNA, DNA i białka mogą zostać pobrane do dalszych analiz w celu zbadania tych komórkowych odpowiedzi immunologicznych u owadów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić iniekcję gąsienic w celu ekstrakcji hemolimfy oraz jak pobrać hemolimfę zawierającą żywe hemocyty.