Ludzki system pseudowysp do synchronicznej oceny dynamiki biosensorów fluorescencyjnych i profili wydzielania hormonów

Nasze laboratorium pracuje nad zrozumieniem, zapobieganiem i odwracaniem dysfunkcji komórek beta i innych nieprawidłowości wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1 i typu 2. Nasze badania koncentrują się na patogenezie cukrzycy u ludzi, integrując badania nad biologią ludzkiej trzustki i wysp trzustkowych oraz zdrowiem i chorobą. Ludzkie wysepki są sferycznymi strukturami 3D, a dostęp do komórek w całej wysepce stanowi pewne wyzwanie eksperymentalne, na przykład podczas próby wprowadzenia bioczujników w celu zrozumienia sygnalizacji komórek wysp trzustkowych.

Nasz protokół pseudowysp pozwala przezwyciężyć to wyzwanie, przeprowadzając manipulacje genetyczne w stanie pojedynczej komórki i reagregując te transdukowane ludzkie komórki wysp trzustkowych w pseudowyspy trzustkowe do dalszych badań. Nasz system pseudowysepek pozwala nam na ekspresję bioczujników na całej wysepce, a nie tylko na jej powierzchni. W połączeniu z naszym systemem obrazowania stylu życia i mikroperfuzji możemy zarówno mierzyć, jak i rejestrować dynamiczne procesy wewnątrzkomórkowe z dalszym wydzielaniem hormonów.

Protokół ten może być zastosowany do udzielenia odpowiedzi na wiele ważnych pytań naukowych. Na przykład strategie wyciszania genów można połączyć z tym podejściem, aby zrozumieć wpływ interesującego genu na funkcję wysp trzustkowych i związane z nią szlaki sygnałowe zarówno globalnie, jak i w sposób specyficzny dla komórki. Zacznij od podłączenia rurki aparatu do mikroperfuzji do uchwytu na wióry.

Przepłukuj linię podstawowym środkiem wydzielającym, takim jak 2-milimolowa glukoza, przez pięć minut. Odessać nadmiar płynu z górnego i dolnego zaworu mikroczipa. Górna połowa mikroczipa zapewnia odpowiednie uszczelnienie studzienek, natomiast dolna połowa zawiera studzienki z dołączoną szklaną szkiełkiem pokrywowym.

Następnie wstępnie zwilż studzienkę 5 mikrolitrami DMEM. Odpipetuj wokół zewnętrznych krawędzi studzienki, aby zwilżyć szczeliny. Wykonaj zdjęcia jasnego i ciemnego pola hodowanych ludzkich wysp rzekomych wyizolowanych z pierwotnych ludzkich wysp trzustkowych.

Za pomocą wstępnie zwilżonej pipety zbierz od 30 do 32 pseudowysepek w 23 mikrolitrach podłoża i powoli dozuj je do środka studzienki mikrochipowej. Upewnij się, że końcówka pipety nie ma żadnych pseudowysp spustowych. Użyj końcówki ładującej żel, aby delikatnie manewrować pseudowysepkami w środku studni, aby uzyskać maksymalny widok pola.

Uchwyć stereoskopowy obraz wysp pseudotrzustkowych w mikrochipie, aby dostosować się do utraty wysp rzekomych. Jeśli wszystkie pseudowysepki z płytki nie są załadowane do mikrochipa, należy odpowiednio dostosować kwantyfikację równoważną wysepki. Umieść spód mikroczipa w uchwycie.

Następnie ostrożnie umieść górną część mikroczipa zieloną uszczelką skierowaną w dół. Trzymając mikroczip na miejscu, zamknij uchwyt, aby zacisnąć mikroczip razem. Przenieść sekretagogi, pompę i mikroczip w uchwycie do komory środowiskowej zamontowanej w mikroskopie konfokalnym i skierować rurkę wylotową z komory do kolektora frakcji.

Umieść w 15-mililitrowych stożkowych rurkach z otworami wywierconymi w ich nasadkach, aby zapobiec dryfowaniu rurki, oddziel nakrętkę i dziczał, a następnie wkręć rurkę do bełkotki, aby zapobiec skręcaniu się linii. Następnie należy ustawić kolektor frakcji tak, aby obracał się co dwie minuty, a następnie załadować go odpowiednią liczbą probówek uwzględniających płukanie i frakcje eksperymentalne. Uruchom pompę, aby dostarczyć podstawową pożywkę glukozową z prędkością 100 mikrolitrów na minutę.

Uważaj na kropelki na końcu wylewki kolektora frakcji, wskazujące na przepływ systemu. Zmniejszony wypływ systemu, widoczny w rurce oznaczonej czerwonym znakiem X, wskazuje na zablokowanie lub wyciek systemu. Po ustaleniu stałego przepływu medium obróć głowicę kolektora frakcji, aby dozować do rurek i uruchomić kolektor frakcji.

Zbierz pierwsze 15 frakcji płukania, aby umożliwić wyrównanie pseudowysepek. Po zapewnieniu ciągłego i dokładnego przepływu medium wyrzuć mycie. Podczas pobierania popłuczyn ustaw mikroskop do obrazowania żywych komórek.

Ustaw soczewkę obiektywu na fluorek UPlan 20X z zoomem 1X, kanały fluorescencyjne na EGFP z emisją ustawioną na 510 nanometrów, długość fali lasera na 488 i długość fali wykrywania na 500 do 600 nanometrów. Ustaw szereg czasowy do obrazu uzyskiwanego co dwie sekundy przez cały eksperyment i szybkość próbkowania na dwie mikrosekundy na piksel. Teraz zidentyfikuj dolną część pseudowysepek w polu widzenia i dostosuj płaszczyznę ogniskowej do 15 mikrometrów powyżej tej pozycji, ramki, która będzie używana podczas obrazowania.

Po zakończeniu mycia naciśnij Start w oprogramowaniu do obrazowania, gdy kolektor frakcji przejdzie do pierwszej frakcji i zbierze ścieki do 1,5-mililitrowych probówek. W odpowiednim momencie należy ręcznie przełączyć rurkę z bufora linii podstawowej na nową rurkę buforową bodźca. Umieść pierwsze 10 kolekcji w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby zapobiec degradacji hormonów, i kontynuuj monitorowanie przepływu systemu, sprawdzając objętość ścieków w każdej probówce.

Po zakończeniu eksperymentu przełącz się z powrotem na podłoże podstawowe, pozwalając pompie wypłukać bufor bodźca przez pięć minut. Zatrzymaj pompę i odłącz rurkę uchwytu mikroczipa od rozpylacza i kolektora frakcji. Zamknij wszystkie drzwiczki komory środowiskowej, aby utrzymać temperaturę.

Przechowuj perfuzaty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszej analizy hormonalnej. Ostrożnie otwórz uchwyt na mikroczip i zdejmij górną część mikroczipa. Wykonaj końcowe zdjęcie mikroskopowe pseudowysp w mikroczipie przed usunięciem.

aby dostosować IEQ ekstraktu wysepki. Za pomocą pipety i mikroskopu przenieś pseudowysepki ze studzienki do 1,5-mililitrowej probówki. Upewnij się, że wszystkie pseudowysepki zostały zebrane za pomocą mikroskopu.

Umyć dwukrotnie 500 mikrolitrami PBS. Następnie wiruj pseudowysepki przez jedną minutę w temperaturze 94 G między każdym myciem. Po zaessaniu supernatantu dodać 200 mikrolitrów kwaśnego etanolu i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odwirować ekstrakty, a następnie podzielić 45 mikrolitrów supernatu na trzy nowe probówki. Przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do analizy zawartości hormonów. Transdukowane ludzkie komórki wysp trzustkowych wykazywały reagregację w czasie z w pełni uformowanymi pseudowyspami utworzonymi po sześciu dniach hodowli.

Komórki zaczęły wykazywać widoczną fluorescencję cADDis w ciągu 48 godzin, a pod koniec okresu hodowli w transdukowanych komórkach wystąpiła wysoka ekspresja biosensora. Pseudowysepki wykazywały średnią skuteczność transdukcji wynoszącą 60% w komórkach alfa i 95% w komórkach beta. Obrazowanie żywych komórek i konfiguracja mikroperfuzji ułatwiły synchroniczne zbieranie wewnątrzkomórkowej dynamiki cAMP poprzez fluorescencję cADDis i wydzielanie hormonów.

Narażenie na 2-milimolową glukozę skutkowało niską i stabilną względną intensywnością cADDis i wydzielaniem insuliny. Zaobserwowano znaczny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP, gdy komórki były wystawione na działanie 20-milimolowej glukozy i IBMX. Towarzyszyło temu zwiększenie insuliny i glukagonu.

Ekspozycja wysp rzekomych na 2-milimolową glukozę i epinefrynę zwiększała wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP, co wiązało się ze zwiększonym poziomem glukagonu.