Wieloparametryczny system perfuzji wysepek w mikroprzepływowym urządzeniu perfuzyjnym

W niniejszej prezentacji przedstawimy oparty na mikroprzepływach system perfuzji wysepek, służący do jednoczesnego pomiaru dynamicznego wydzielania insuliny, napływu wapnia oraz zmian potencjału mitochondrialnego w wysepkach trzustkowych w odpowiedzi na sekretagogi insuliny. System perfuzji składa się z trójwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego, pomp strzykawkowych i kolektora frakcji insuliny. Napływ wapnia oraz potencjały mitochondrialne indukowane przez sekretagogi są obrazowane przy użyciu zestawu z mikroskopem fluorescencyjnym.

Cześć, nazywam się Ola i jestem pracownikiem laboratorium dr. Val Holter w Katedrze Chirurgii Transplantacyjnej na Uniwersytecie Illinois w Chicago. Cześć, jestem Don Lee, również z laboratorium dr Holter. Cześć, nazywam się Tricia Hart, również z laboratorium dr Holter.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę jednoczesnego obrazowania powiek z wykorzystaniem liniowego gradientu glukozy. Procedurę tę zastosowaliśmy w naszym laboratorium do badania obrazowania i funkcji powiek. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Urządzenie mikrofluidyczne wykorzystane w tej procedurze składa się z trzech warstw utwardzonego PDMS, wytworzonych za pomocą standardowej fotolitografii. Pierwsza warstwa, wykonana z silikonowego wzorca, zawiera wgłębienia urządzenia mikrofluidycznego o głębokości 150 micrometers i średnicy 500 micrometers, które mają za zadanie stabilnie utrzymać oczka w miejscu. Druga warstwa posiada kanały o wysokości 500 micrometers i szerokości two millimeters.

Środkowa część kanału jest rozszerzona, aby rozproszyć przepływ w celu lepszej wymiany roztworu. Wewnątrz urządzenia, w studzience wymiany, wykonuje się otwór o wysokości 3 mm i szerokości 7 mm na środku warstwy. Trzecia warstwa to gruba płyta z PDMS. Aby przygotować tę warstwę, należy wykonać małe otwory po obu stronach, które będą odpowiadać wlotowi i wylotowi kanału.

W przypadku drugiej warstwy, po wygenerowaniu wszystkich trzech warstw, pierwszą warstwę przywiązuje się do szkiełka przedmiotowego tak, aby studzienki były skierowane do góry. Następnie drugą warstwę przywiązuje się do pierwszej warstwy z odstępami między kanałami skierowanymi do góry. Na koniec trzecią warstwę przywiązuje się do drugiej warstwy.

Po połączeniu warstw urządzenie jest gotowe do wykorzystania w eksperymentach. Używając strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej 70% etanolem i podłączonej do portu wlotowego urządzenia za pomocą drenu Tygon, należy wysterylizować urządzenie mikroprzepływowe, przepuszczając etanol przez kanały urządzenia. Następnie, korzystając z tej samej konfiguracji, należy przepuścić wodę dejonizowaną, aby wypłukać etanol.

Po sterylizacji urządzenia należy umieścić je na podgrzewanym stoliku mikroskopu za pomocą rurek tigon, a pompy strzykawkowe zawierające roztwory wysokiego i niskiego stężenia glukozy podłączyć do łącznika Y. Następnie należy podłączyć je do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Wylot urządzenia mikroprzepływowego należy podłączyć do kolektora frakcji.

Upewnij się, że przewody spoczywają na płytce grzewczej ustawionej na 37 degrees Celsius. Bardzo ważne jest utrzymanie roztworów w temperaturze fizjologicznej przez cały czas trwania eksperymentu. Następnie użyj programu LabVIEW, aby zainicjować gradient glukozy, który będzie perfundowany przez sieć mikroprzepływową podczas eksperymentu.

Oprogramowanie to zmienia szybkość przepływu dwóch roztworów glukozy. Poprzez sterowanie pompami strzykawkowymi można tutaj tworzyć różne profile gradientu glukozy: liniowe, dzwonowate oraz prostokątne. W eksperymencie tym przedstawiono porównanie z obliczonymi wartościami oczekiwanymi; zostanie zastosowany liniowy gradient glukozy od 2 mM do 25 mM przy zmiennej szybkości przepływu obu roztworów glukozy wynoszącej 0,01 ml/min oraz stałej szybkości przepływu 0,25 ml/min wlewanych do urządzenia po zmieszaniu roztworów.

Po wybraniu odpowiedniego profilu gradientu należy sprawdzić jego stabilność. Najpierw uruchom system gradientowy. Następnie uruchom zbieracz frakcji i zbierz osiem frakcji po 1 mL do probówek typu Eppendorf.

Następnie, używając glukometru, zmierz stężenie glukozy w każdej probówce, wpisując dane do programu Excel. Przeanalizuj wyniki uzyskane z glukometru. Następnie zastąp strzykawkę z wysokim stężeniem glukozy strzykawką zawierającą 0,5% BSA w buforze Krebs-Ringer i przepłucz urządzenie 50 mililitrami roztworu z prędkością 1 ml/min.

Zapobiegnie to niespecyficznej adsorpcji insuliny do ścianek mikrokanałów, co zapewni dokładność późniejszych pomiarów poziomu wydzielanej insuliny po perfuzji z BSA. Zastąp ją roztworem wysokiego stężenia glukozy. Zawieś 25 do 30 ręcznie wybranych wycinków oka myszy w buforze Krebsa-Ringera z 2 mM glukozą, zawierającym barwnik wskaźnikowy dla wapnia fira 2:00 AM oraz barwnik wskaźnikowy potencjału mitochondrialnego rumine 1 2 3, i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Po inkubacji odłącz urządzenie od systemu perfuzyjnego i ostrożnie wprowadź wysepek do urządzenia mikroprzepływowego, wkładając końcówkę pipety zawierającej wysepki do portu wlotowego i powoli dozując wysepek. Po załadowaniu ponownie podłącz urządzenie do systemu perfuzyjnego, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie uruchom pompę strzykawkową, aby rozpocząć perfuzję wysepków roztworem KRB zawierającym 2 mM glukozy.

Ten etap służy do wypłukania nadmiaru barwnika z pożywki oraz wyznaczenia zestawów filtrów wzbudzenia i emisji oraz czasów ekspozycji, które będą stosowane podczas eksperymentu. Następnie należy ustawić kolektor frakcji tak, aby pobierał próbki w odstępach jednominutowych, jednocześnie traktując oczka roztworem o niskiej zawartości glukozy. Użyj narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI) w oprogramowaniu do obrazowania PCI, aby zdefiniować obszary lub oczka, które mają zostać zobrazowane.

Następnie zakreśl obszar tła, który zostanie odjęty po 10-minutowym płukaniu komórek, uruchom kolektor frakcji gradientu glukozy i rozpocznij obrazowanie time-lapse. Po 30 minutach wyłącz oprogramowanie oraz pompę strzykawkową z wysokim stężeniem glukozy. Kontynuuj perfuzję z niskim stężeniem glukozy, aby wypłukać efekt działania wysokiego stężenia glukozy.

Po 10 minutach zatrzymać przepływ niskiego stężenia glukozy, wyłączając pompę strzykawkową. Po perfuzji wyeksportować dane do programu Excel w celu analizy. Ilość insuliny wydzielonej do perfuzatu można oznaczyć za pomocą testu ELISA dla wysp trzustkowych myszy.

Przeperfumowano liniowym gradientem glukozy od 2 do 25 milimolarnych, jak pokazano tutaj. Napływ wapnia i sekrecja insuliny zostają wywołane po około 13 minutach perfuzji, co odpowiada stężeniu glukozy 6 milimoli. Zmiany potencjałów mitochondrialnych są widoczne wcześniej, zgodnie z oczekiwaniami, około 11 minuty.

Te dane wykazują zalety wykorzystania tej sieci mikroprzepływowej do charakteryzacji fizjologii oczek. Właśnie pokazaliśmy, jak używać naszego urządzenia do mikroprzepływowej perfuzji równoległej w badaniach fizjologii oczek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że w urządzeniu nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ mogłyby one spowodować przemieszczenie się oczek podczas eksperymentu.

Ponadto przepływ można dostosować do 1 ml na minutę bez zakłócania oczek. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymencie.