Indukcja anergii specyficznej dla alloantygenu w ludzkich mononuklearnych komórkach krwi obwodowej poprzez stymulację alloantygenem z blokadą sygnału kostymulującego

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest aktywacja allospecyficznych limfocytów T dawcy przez stymulację ex vivo antygenami allo biorcy w obecności przeciwciał blokujących kostymulację limfocytów T przez komórki prezentujące antygen za pośrednictwem receptora CD 28. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wyizolowanie PBMC od dwóch różnych zdrowych dawców. Następnie tworzona jest masowa kokultura aktywująca allo poprzez inkubację populacji PBMC niedopasowanych pod względem HLA w obecności przeciwciał monoklonalnych przeciwko ligandom B 7.1 i B 7.2 w celu zablokowania stymulacji CD 28.

Następnie skuteczność allo-energizacji jest mierzona za pomocą pierwotnych i wtórnych reakcji mieszanych limfocytów (MLR). Na koniec swoistość allo-energizacji jest oceniana poprzez oznaczenie odpowiedzi specyficznych dla CMV oraz dla osób trzecich. Uzyskane wyniki wykazują, że limfocyty T dawcy stają się hiporeaktywne na późniejszą stymulację alloantygenową, podczas gdy limfocyty T dawcy niereaktywne w sposób allo pozostają nienaruszone i funkcjonalne.

Z sukcesem zastosowaliśmy tę strategię w poprzednich i trwających pilotażowych badaniach klinicznych dotyczących infuzji allostymulowanych komórek T dawcy podczas i po transplantacji komórek macierzystych przy niezgodności HLA, obserwując poprawę reconstitucji odporności, mniejszą liczbę infekcji oraz mniej nasilone ostre i przewlekłe reakcje przeszczep przeciwko gospodarzowi w porównaniu z historyczną grupą kontrolną biorców niezmodyfikowanych przeszczepów przy niezgodności HLA. Główną zaletą strategii allostymulacji jest minimalizacja efektów poza celowych, ponieważ technika ta nie redukuje odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla patogenów lub antygenów związanych z nowotworem ani nie eliminuje regulacyjnych komórek T CD4 z puli limfocytów T dawcy. Procedurę zaprezentuje Christine Vin, naukowiec w naszym laboratorium. Pierwszym krokiem jest pobranie krwi od dwóch zdrowych ochotników będących dawcami.

Komórki od jednego dawcy będą służyć jako komórki odpowiadające, a komórki od innego dawcy jako komórki stymulujące. Następnie wyizoluj PBMC z krwi metodą wirowania w gradiencie gęstości przy użyciu fial pac. Barw niewielką ilość komórek błękitem trypanowym i policz żywe PBMC za pomocą hemo cytometer reus.

Rozdziel PBMC od każdego dawcy w objętości 10 mililitrów pełnej pożywki hodowlanej, przy stężeniu 1 miliona żywych komórek na mililitr, do osobnych probówek stożkowych o pojemności 15 mililitrów. Wyznacz jedną probówkę z PBMC dawcy jako stymulatory, a drugą jako respondery, aby przygotować masową ko-kulturę aktywacji allogenicznej.

Dodaj 100 µg przeciwciał anty-B 7.1 i anty-B 7.2 do probówki o pojemności 15 ml oznaczonej jako stymulator. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki i inkubuj przez 30 minut. Po zakończeniu okresu inkubacji napromieniuj PBMC stymulatora i przenieś je do kolby hodowlanowej T 25 o pojemności 50 cm³ z przepuszczalną dla gazów zakrętką.

Oznacz kolbę jako hodowlę allogenicznego węgla masowego. Następnie do kolby dodaj 10 mililitrów PBMC respondenta od innego dawcy w stężeniu 1 milion na mililitr w podłożu kompletnym. Do kolby dodaj kolejne 100 mikrogramów każdego z przeciwciał antib 7.1 i Antib 7.2, a następnie delikatnie wymieszaj przed umieszczeniem kolby w pozycji pionowej w inkubatorze na 72 godziny.

Następnie naświetl kolejne 10 milionów PBMC stymulatora do przygotowania kontrolnej kokultury masowej bez przeciwciał blokujących, a następnie przenieś je do kolby hodowlaną o pojemności 25 cm² (50 cm³). Opisz kolbę jako bulk control co-culture. Do kolby dodaj 10 ml tych samych PBMC respondenta, które zostały użyte do masowej kokultury alloenergetyzującej, w stężeniu 1 milion na ml w pełnej pożywce, i delikatnie wymieszaj przed ustawieniem kolby pionowo w inkubatorze na 72 godziny.

Kolejnym krokiem jest pomiar funkcji puli allostymulowanych donatorskich limfocytów T w tym samym dniu, w którym przygotowano zbiorcze hodowle współhodowlane. Do każdego z trzech mierzonych punktów czasowych należy przygotować pierwotną reakcję MLR w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Następnie należy przelać 5 ml z każdej zbiorczej hodowli kontrolnej oraz allostymulowanej współhodowli do probówek o pojemności 15 ml.

Następnie pipetuj 200 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórzeń w dołkach na każdej z trzech płytek. Dołki z komórkami z masowych kultur kontrolnych w niskiej temperaturze oznacz jako „brak blokady kostymulującej” lub „no CSB”, a dołki z komórkami z masowych kultur allostymulujących w niskiej temperaturze oznacz jako „CSB”. Następnie do sześciu dołków na każdej płytce dodaj 200 µL pożywki kompletnej jako kontrole negatywne.

Na koniec dodaj 200 µL PBS do wszystkich pustych studni, aby ograniczyć parowanie, a następnie umieść płytki w inkubatorze na 72 h po przygotowaniu zbiorczych kokultur. Oznacz jedną płytkę 96-dołkową UBO jako „wtórny MLR” dla każdego z trzech mierzonych punktów czasowych. Aby przygotować komórki respondera do wtórnego MLR, przenieś 5 ml z każdej z kontrolnych oraz alloenergetyzujących zbiorczych kokultur do probówek o pojemności 15 ml i wiruj je przez 5 do 10 min przy 2000 RPM w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj komórki dwukrotnie, ostrożnie aspirując supernatanty, rozbijając osady, dodając 10 ml pełnej pożywki do każdej probówki, a następnie ponownie wirując komórki po drugim przemyciu.

Resuspendować komórki w 1 ml pełnej pożywki. Wykorzystać barwienie błękitem trypanowym do policzenia żywych komórek i dostosować stężenie komórek do poziomu 1 miliona żywych komórek responderów na 1 ml. Pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórzeń w każdej płytce.

Oznacz te studzienki jako stymulacja pierwszej strony lub stop stopu FP. Następnie pipetuj 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do kolejnych trzech studzienek na każdej płytce i oznacz te studzienki jako stymulacja CD 3/28 PBMC od tego samego dawcy, który dostarczył PBMC stymulatora pierwszej strony do allo. Energetyzowane i kontrolne kokultury są używane jako komórki stymulujące dla wtórnego MLR; zawieś 10 milionów PBMC dawcy pierwszej strony w stężeniu 1 milion/mL i dodaj irradiat.

100 µL napromieniowanych komórek stymulujących do studzienek oznaczonych jako fp allo restimulation na każdej wtórnej płytce MLR. Jako kontrole dodatnie dodaj po 1 µL przeciwciał monoklonalnych CD3 i CD28 oraz 98 µL pełnej pożywki do studzienek oznaczonych jako CD 3 28 stimulation na każdej wtórnej płytce MLR. Dodatkowo dodaj 200 µL pełnej pożywki do sześciu pustych studzienek na każdej płytce, aby służyły jako kontrole ujemne, oraz dodaj 200 µL PBS do wszystkich pozostałych pustych studzienek w celu ograniczenia parowania.

Umieść płytki w inkubatorze. Kolejnym krokiem jest pomiar swoistości; do przetestowania swoistości procesu allo w wtórnej reakcji MLR wykorzystuje się allo PBMC izolowane od nowego zdrowego dawcy, nazwanego dawcą trzecim. Zawiesić PBMC od dawcy trzeciego w stężeniu 1 milion komórek na mililitr i napromieniować; oznakować 3 płytki 96-dołkowe dla wtórnej MLR na określenie swoistości w dniu trzecim, piątym i siódmym.

Aby przygotować komórki odpowiadające do wtórnej reakcji mieszanej leukocytów (MLR) w celu pomiaru swoistości, przenieś pięć mililitrów z każdej z masowych kokultur kontrolnych i allostymulujących do probówek o pojemności 15 mililitrów i wiruj probówki od pięciu do 10 minut przy 2000 RPM. Następnie przemyj komórki dwukrotnie, ostrożnie odsysając nadsączniki, rozbijając osady, dodając 10 mililitrów pełnej pożywki do każdej probówki i ponownie wirując komórki po drugim przemyciu. Resuspenduj komórki w jednym mililitrze pełnej pożywki.

Zastosuj barwienie błęknitem trypanowym w celu policzenia komórek i dostosuj stężenie komórek do poziomu 1 miliona żywych komórek respondujących na mililitr, a następnie pipetuj 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech powtórnych studni na każdej płytce. Oznacz te studnie jako TP lub stymulacja allo strony trzeciej. Następnie dodaj 100 µL naświetlonych komórek stymulatorów TP do studni oznaczonych jako stymulacja allo TP.

Aby dalej przetestować swoistość odpowiedzi allo, mierzy się odpowiedzi na patogeny po energizacji PBMC od dawców z uprzednio ustalonymi odpowiedziami proliferacyjnymi na CMV etykieta 3 96. Płytki wielodołkowe wtórne M-L-R-C-M-V dzień trzeci, piąty i siódmy, a następnie przenieść 5 ml z każdej z kontrolnych kultur masowych oraz allo-energizujących kultur współdzielonych do probówek o pojemności 15 ml. Następnie wyprać, policzyć i resuspenderć komórki w stężeniu 1 milion na ml w kompletnej pożywce, pipetować 100 µL zawiesiny komórkowej z każdej probówki do trzech dołków na każdej płytce i oznaczyć te dołki jako stymulacja CMV.

Następnie dodaj 0,1 µL lizatu CMV w 100 µL kompletnej pożywki do studni oznaczonych jako stymulacja CMV. Następnie dodaj 200 µL kompletnej pożywki do sześciu studni na każdej płytce jako kontrole negatywne. Na koniec dodaj 200 µL PBS do wszystkich pustych studni, aby ograniczyć parowanie, i umieść płytki w inkubatorze w celu pomiaru proliferacji w pierwotnej i wtórnej reakcji MLR.

Dodaj jeden mikrokuri tritylowanej tymidyny do kontroli negatywnej oraz do dołków zawierających komórki na 16 godzin przed zebraniem płytek. Zbierz tymidynę na jednej macie filtracyjnej dla każdej płytki, korzystając z systemu TomTec harvester lub podobnego urządzenia. Susz maty filtracyjne przez jedną godzinę.

Następnie umieść je w oddzielnych woreczkach na próbki. Do każdego z nich dodaj 5 mL płynu scyntylacyjnego i szczelnie zamknij. Zmierz wbudowanie tritiu-tymidyny w ciągu ostatnich 16 godzin eksperymentu, odczytując maty filtracyjne za pomocą mikrobeta-licznika scyntylacyjnego Wallach lub urządzenia podobnego, wykorzystując PBMC stymulatora i respondenta przy niezgodności HLA.

Na tej rycinie widać, że obecność blokady kostymulacyjnej w pierwotnej reakcji mieszanej limfocytów (MLR) redukuje średnią alloproliferację PBMC responderów w piątym dniu do około 30% wartości obserwowanej w kontrolnej pierwotnej MLR bez blokady kostymulacyjnej. Odpowiada to średniemu zahamowaniu pierwotnej alloproliferacji na poziomie około 70% w piątym dniu. Jak pokazano na tej rycinie.

Na tej figurze widać, że w wtórnej reakcji mieszanej limfocytów (MLR) proliferacja PBMC aktywowanych allogenicznie w odpowiedzi na stymulację allogeniczną pierwszej strony w piątym dniu zazwyczaj wynosi od 10 do 15% wartości obserwowanej dla kontrolnych PBMC. Odpowiada to średniemu zahamowaniu proliferacji na poziomie 85 do 90%, co wykazuje, że PBMC aktywowane allogenicznie są hiporeaktywne na stymulatory allogeniczne pierwszej strony. Jak wynika z tej figury, po opanowaniu metody, masowe kokultury z allogenicznie aktywowanymi mononuklearnymi komórkami krwi obwodowej dawcy można przygotować w ciągu dwóch do trzech godzin.

Metodę tę można łatwo zestandaryzować do zastosowań klinicznych w celu generowania limfocytów T dawcy o zredukowanej alloreaktywności, przy zachowaniu odporności specyficznej przeciwko patogenom. Takie komórki mogą być przenoszone adoptywnie w kontekście allogenicznego przeszczepienia krwiotwórczych komórek macierzystych, aby poprawić odbudowę odporności bez wywoływania nadmiernej choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować sprawnie.

Pomaga to zachować żywotność komórek oraz zapobiega nieswoistej aktywacji lub utracie komórek prezentujących antygen. W przypadku użycia krio-konserwowanych PBMC jako stymulatorów lub responderów, należy zastosować zwalidowany protokół reanimacji zamrożonych komórek, który zapewnia stabilnie wysoką wydajność uzyskiwania żywotnych komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić allo-immunizację ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej oraz jak wykonać testy oceniające skuteczność i swoistość tej procedury; opisana strategia może być wykorzystana do generowania ludzkich komórek T od dawcy o zredukowanej odpowiedzi allogenicznej, co może być zastosowane klinicznie w celu poprawy rekonstrukcji immunologicznej po allogenicznej transplantacji hematopoetycznych komórek macierzystych.