Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium
3 listopada 2023
To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.
Nasze laboratorium ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmu molekularnego chorób siatkówki z naciskiem na niezaspokojone potrzeby medyczne pacjentów. Naszym celem jest opracowanie dla nich skutecznych metod leczenia, takich jak terapie oparte na komórkach macierzystych. Kriokonserwacja komórek RP pochodzących z komórek macierzystych jest ważnym krokiem w terapii zastępczej RP.
Obecnie komórki są zamrażane na różnych etapach, co skutkuje bardzo zmiennymi wskaźnikami przeżywalności podczas siewu. Jest to potrzebne do określenia optymalnego stopnia zaawansowania komórek do zamrażania tych komórek. Nasz protokół zapewnia proste, wydajne i niedrogie sposoby zamrażania komórek RP poprzez określenie fazy wykładniczej komórek RP do zamrożenia.
Jest mniej zależny od metod różnicowania lub linii komórkowych. Na początek rozcieńczyć fiolkę z rozmrożoną zimną matrycą membrany podstawnej z 12 mililitrami DMEM/F12. Dobrze wymieszaj zawiesinę.
Dodaj jedno szkiełko nakrywkowe do każdego dołka płytki 24-dołkowej. Następnie odpipetować 250 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu matrycowego do każdej studzienki. Odrzucić pożywkę hodowlaną z hodowanych płytek komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z hESC.
Umyj płytki dwa razy jednym mililitrem podgrzanego PBS na studzienkę. Następnie dodaj 0,5 mililitra odczynnika do dysocjacji komórek do dołków płytek hodowlanych i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby rozpocząć trawienie. Po inkubacji obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić koniec trawienia.
Teraz za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie odpipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół 10 razy. Dodać podgrzaną pożywkę hodowlaną, aby rozcieńczyć zawiesinę. Następnie odwiruj go w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Wylać supernatant z probówki odwirowej. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Użyj pipety, aby wymieszać komórki od 10 do 15 razy.
Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 mikrometrów. Następnie policz komórki nabłonka barwnikowego siatkówki. Zassać roztwór powlekający przed posiewem.
Następnie dodaj jeden mililitr pożywki hodowlanej do każdej studzienki i zasiej komórki na szkiełkach nakrywkowych. Po włączeniu i zabarwieniu EdU uchwyć obrazy pięciu losowych pól za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Oblicz procent komórek EdU-dodatnich.
Następnie wykreśl odpowiednie krzywe proporcji w czasie, aby wygenerować krzywą wzrostu. Na koniec określ okno zamrażania od fazy wykładniczej dla każdej linii komórkowej. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki początkowo utraciły swoją charakterystyczną sześciokątną morfologię, ale później odzyskały ją w wykładniczej fazie wzrostu.
Kiedy komórki były hodowane przez dodatkowy tydzień, proliferacja komórek zmniejszyła się. Test proliferacji EdU potwierdził, że komórki P2 dnia piątego wykazywały wyższy wskaźnik proliferacji, podczas gdy komórki P2 dnia 11 weszły w fazę spowolnienia. Na początek należy zdysocjować komórki nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzące z hESC.
Przygotować zawiesinę komórek, a następnie policzyć komórki. Teraz odwiruj komórki w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Wylać supernatant.
Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w podłożu kriokonserwującym. Następnie przenieś jeden mililitr zawiesiny komórek do 1,2-mililitrowej fiolki kriogenicznej. Umieść fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania i zamrażaj przez noc w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. Aby rozmrozić zamrożone fiolki, najpierw podgrzej pożywkę w metalowych kulkach podgrzanych do 37 stopni Celsjusza. Napełnij 10 mililitrów podgrzanej pożywki hodowlanej do 15-mililitrowej probówki.
Teraz wyjmij fiolki kriogeniczne z ciekłego azotu i umieść je w automatycznym systemie rozmrażania w celu szybkiego rozmrożenia. Wrzuć od 0,5 do jednego mililitra podgrzanej pożywki hodowlanej do fiolki kriogenicznej, aby zapewnić stopniową adaptację komórek. Następnie odpipetować od 1,5 do dwóch mililitrów zawiesiny ogniw do 15-mililitrowej probówki z medium.
Odwirować komórki w temperaturze 250G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odrzucić supernatant. Zawiesić osad w dwóch mililitrach ciepłego podłoża.
Załaduj komórki do hemocytometru i policz je, aby określić wskaźniki powrotu do zdrowia i przeżycia. Hoduj rozmrożone komórki na płytkach pokrytych błoną podstawną w pożywce z Y27632. Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki, które zostały zamrożone w piątym dniu w fazie wykładniczej, wykazywały wyższy wskaźnik przyczepiania się po rozmrożeniu.
W stosunku do ich charakterystycznej sześciokątnej morfologii, komórki zamrożone w innych punktach czasowych miały fenotyp fibroblastyczny. Komórki P2 w piątym dniu wykazywały wyższą ekspresję i bardziej prawidłowo zlokalizowane markery komórkowe 28 dni po rozmrożeniu. Zauważono, że różne podłoża do krioprezerwacji działały równie dobrze w osiąganiu wysokiej żywotności komórek i przyczepiania po rozmrożeniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół efektywnej kriokonserwacji ludzkich komórek nabłonka pigmentowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych. Celem protokołu jest zwiększenie przeżywalności tych komórek podczas zamrażania, co ma kluczowe znaczenie dla terapii zastępczych siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Badania nad siatkówką
Wprowadzenie
- Choroby siatkówki stanowią istotne wyzwanie medyczne.
- Opracowywane są terapie oparte na komórkach macierzystych w celu ich leczenia.
- Kriokonserwacja jest niezbędna dla zachowania żywotności komórek nabłonka pigmentowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych.
- Obecne metody zamrażania dają zróżnicowane wyniki przeżywalności.
Cel badania
- Określenie optymalnego stopnia dojrzałości komórek do zamrażania komórek nabłonka barwnego siatkówki.
- Przedstawienie prostego i efektywnego protokołu kriokonserwacji.
- Poprawa spójności wskaźników przeżywalności komórek po rozmrożeniu.
Zastosowane metody
- Ocena fazy wykładniczej komórek RP przed zamrażaniem.
- Opracowanie kosztowo efektywnego protokołu kriokonserwacji.
- Ocena przeżywalności komórek po różnych etapach zamrażania.
- Porównanie wyników z istniejącymi metodami kriokonserwacji.
Główne wyniki
- Nowy protokół znacząco poprawia przeżywalność komórek RP.
- Zidentyfikowano optymalny stopień rozwoju komórek w celu skutecznego zamrażania.
- Zwalidowano kosztowo efektywne metody w porównaniu z podejściami tradycyjnymi.
- Wyniki potwierdzają wykonalność terapii opartych na komórkach macierzystych w leczeniu chorób siatkówki.
Wnioski
- Badanie przedstawia niezawodną metodę kriokonserwacji komórek RP.
- Poprawa wskaźników przeżywalności może zwiększyć skuteczność terapii siatkówki.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w zastosowaniach klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spójna kriotransplantacja komórek nabłonka barzołowatego siatkówki (RPE) pochodzących z hESC rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w produkcji terapii komórkowych dla chorób degeneracyjnych siatkówki. Optymalizacja etapu zamrażania z wykorzystaniem ilościowych testów proliferacji zwiększa żywotność po rozmrożeniu, co wspiera skalowalną bankowość komórek i niezawodne zastosowania w dalszych etapach procesu. Niniejszy protokół umożliwia zstandaryzowane, powtarzalne przechowywanie funkcjonalnych komórek RPE, ułatwiając ciągłość translacyjną oraz zminimalizowany pod kątem ryzyka rozwój w ramach procesów medycyny regeneracyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Ilościowe znakowanie EdU umożliwia precyzyjną identyfikację fazy wzrostu wykładniczego w celu optymalizacji kriokonserwacji.
- Poprawiona żywotność po rozmrożeniu wspiera walidację funkcjonalną tożsamości i fenotypu komórek RPE.
- Zestandaryzowana bankowość komórek redukuje zmienność biologiczną, zwiększając wiarygodność predykcyjną w dalszych badaniach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Spójne odzyskiwanie żywych komórek RPE umożliwia wiarygodne przygotowanie systemów komórkowych istotnych dla badanych chorób do celów przesiewowych.
- Protokół wspiera powtarzalność i skalowalność w ramach wysokoprzepustowej oceny związków.
- Zwalidowane okno mrożenia zapewnia standaryzację testów pomiędzy partiami i liniami komórkowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Stabilne, funkcjonalne komórki RPE po rozmrożeniu ułatwiają przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej.
- Adaptacyjność protokołu do różnych metod różnicowania i linii komórkowych wspiera szersze zastosowania translacyjne.
- Umożliwia podejmowanie decyzji w zakresie rozwoju kandydatów do terapii komórkowej w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół kriokonserwacji jest zintegrowany z procesem terapii komórkowej – od wczesnych etapów odkrywania po rozwój przedkliniczny – wspierając tworzenie stabilnych banków komórek oraz odzyskiwanie funkcji komórkowych dla zastosowań w dalszych etapach procesu.
- Biologia odkrywcza: Wyznaczanie fazy wzrostu w oparciu o EdU minimalizuje ryzyko podczas tworzenia banków komórek, zapewniając optymalną żywotność i zachowanie fenotypu.
- Przesiewanie: Standaryzacja regeneracji po rozmrożeniu umożliwia powtarzalne przygotowanie testów i badanie związków.
- Analityka: Ilościowe liczenie komórek i ocena żywotności dostarczają praktycznych wskaźników do optymalizacji procesu.
- Badania translacyjne: Funkcjonalna regeneracja RPE po rozmrożeniu wspiera rozwój modeli przedklinicznych i dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Elastyczność protokołu pozwala na adaptację do innych zróżnicowanych typów komórek, zwiększając wartość platformy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększona pewność predykcyjna i walidacja celów dzięki standaryzacji konserwacji komórek.
- Wartość operacyjna: Poprawiona powtarzalność, skalowalność i efektywność kosztowa w procesach tworzenia banków komórek.
- Wartość strategiczna: Wsparcie dla solidnych decyzji typu go/no-go oraz redukcja ryzyka biologicznego na późnych etapach programów terapii komórkowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji skorygowanej o ryzyko oraz rozwoju zasobów medycyny regeneracyjnej.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórkowych, testów proliferacji EdU oraz technik kriokonserwacji.
- Niezbędny jest dostęp do mikroskopii fluorescencyjnej, zautomatyzowanych systemów rozmrażania oraz standardowej infrastruktury bankowania komórek.
- Dla zapewnienia powtarzalności kluczowa jest standaryzacja procesu wyznaczania okna zamrażania pomiędzy zespołami.
- Protokół jest możliwy do dostosowania do różnych linii RPE pochodzących z hESC oraz różnych metod różnicowania.
- Żywotność oraz odzyskanie fenotypu mogą się różnić w zależności od typu komórek i zastosowanego medium do kriokonserwacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:07
Human Embryonic Stem Cell‐Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination
4:11
Preservation of Human Embryonic Stem Cell‐Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation
