Zastosowania mikroprzepływowe w diagnostyce jednorazowej

Nazywam się Catherine CloudBridge i jestem profesorem w zakresie produkcji, inżynierii oraz inżynierii biomedycznej na Boston University. Jestem również dyrektorem Laboratorium Biomedycznych Mikrourządzeń i Mikrośrodowisk. Pracujemy przede wszystkim nad tworzeniem jednorazowych narzędzi diagnostycznych do zastosowań w warunkach ograniczonych zasobów.

W celu stworzenia tych urządzeń wykorzystujemy mikrofluidykę. Interesują nas właściwie dwie dziedziny badań. Przede wszystkim skupiamy się na analizie interakcji biomolekuł i komórek z powierzchniami polimerów z tworzyw sztucznych.

To nasz główny obszar badań. Prace te materializują się w zastosowaniach mikrofluidycznych dla diagnostyki jednorazowej. Zatem w laboratorium tworzymy urządzenia mikrofluidyczne.

W materiałach termoplastycznych nie stosujemy zazwyczaj PDMS, czyli gumowatego materiału, którego większość osób używa do tworzenia układów mikroprzepływowych w laboratorium. Nasze urządzenia wykonujemy z termoplastów. Jesteśmy zainteresowani wykorzystaniem tych termoplastycznych urządzeń do prowadzenia biologii molekularnej w skali mikro w taki sposób, aby biologia molekularna mogłaby być realizowana w terenie, z dala od scentralizowanego laboratorium.

W praktyce laboratoryjnej polega to na tworzeniu małych plastikowych kart, wewnątrz których znajdują się kolumny do ekstrakcji do fazy stałej, kolumny do lizy komórek lub kolumny do mieszania. Jako technikę detekcji stosujemy również reakcję łańcuchową polimerazy na chipie. Wszystkie te elementy są zintegrowane w niewielkim urządzeniu, które w perspektywie długofalowej badań miałoby stać się zintegrowanym urządzeniem przenośnym, możliwym do wykorzystania w terenie lub w warunkach, w których niedostępne byłoby pełnowymiarowe laboratorium z całą towarzyszącą mu wirówką, inkubatorami grzewczymi i tym podobnymi.

W idealnym scenariuszu chcielibyśmy zacząć od ludzkiej próbki, takiej jak na przykład krew, mocz, kał lub wymaz z nosogardzieli, który stanowiłby śluz. Następnie, na wyjściu z chipa, chcielibyśmy otrzymać odpowiedź „tak” lub „nie” na pytanie, czy dana osoba jest zakażona konkretnym mikroorganizmem. Robimy to poprzez wykrywanie DNA lub RNA, w zależności od rodzaju mikroorganizmu, tego konkretnego patogenu w próbce pacjenta.

Wyzwania techniczne pojawiają się głównie po stronie przygotowania próbek. Rozpoczynając pracę z krwią, kałem lub moczem, należy przejść od stanu, w którym dysponuje się zanieczyszczoną próbką ludzką zawierającą wiele potencjalnych cząstek stałych lub inhibitorów PCR oraz innych technik amplifikacji, do uzyskania bardzo czystej, wyeluowanej próbki kwasów nukleinowych. Można ją następnie wykorzystać do amplifikacji lub poszukiwania konkretnego DNA lub RNA, co pozwoli stwierdzić, czy poszukiwany mikroorganizm był obecny w próbce.

Aby oczyścić te próbki, należy wykonać kilka czynności. Po pierwsze, należy przefiltrować próbkę, co w zależności od jej rodzaju może obejmować filtrację wstępną lub krótkie wirowanie przed naniesieniem próbki na chip. Zawsze staramy się zaczynać od próbek w takiej formie, w jakiej otrzymujemy je od klinicysty.

W przypadku moczu, kału i wymazów z nosogardzieli naszym celem jest umożliwienie klinicyście wykonywania swojej pracy w zwykły sposób i pobierania próbek zgodnie ze standardowymi procedurami. Następnie pobieramy tę próbkę i nanosimy ją na chipy. Jeśli na tym etapie wymagana jest dalsza filtracja, odbywa się ona bezpośrednio w chipie.

Drugi krok polega na tym, że ponieważ przeprowadzamy analizy molekularne, musimy zlizować komórki i mikroorganizmy znajdujące się w danej próbce. Wykonujemy zatem etap lizy, który zazwyczaj polega na przepuszczeniu próbki przez filtr o małym rozmiarze porów. Czasami filtr ten zawiera również nanocząsteczki, takie jak nanorurki węglowe, które posiadają ostre krawędzie i mogą być wykorzystane do rozrywania organizmów o bardziej wytrzymałych ścianach komórkowych, takich jak C difficile – bakteria Gram-dodatnia, z którą pracujemy, a która jest bardzo trudna do lizowania.

W związku z tym musimy zastosować bardziej wytrzymałe kolumny do lizy. Zazwyczaj przeprowadzamy połączoną lizę chemiczną i mechaniczną wewnątrz chipa. Następnie naszym celem jest pobranie lizatu i wyekstrahowanie z niego oczyszczonych kwasów nukleinowych.

Następnie przepuszczamy lizat przez kolumnę do ekstrakcji w fazie stałej, która znajduje się w chipie mikrofluidycznym. Ta kolumna do ekstrakcji w fazie stałej jest wykonana z tworzywa sztucznego i powstaje wewnątrz kanału mikrofluidycznego za pomocą chemii inicjowanej światłem, po zakończeniu procesu jego produkcji. Jest ona również zazwyczaj impregnowana cząsteczkami krzemionki, ponieważ chcemy wiązać i uwalniać kwasy nukleinowe.

W niektórych przypadkach, jeśli chcemy specyficznie wiązać i uwalniać mRNA, stosujemy kulki oligo DT lub kulki z konkretnymi przeciwciałami, gdy chcemy wiązać i uwalniać określone białka. Możemy tworzyć kolumny ekstrakcyjne, które realizują wszystkie te funkcje. Dzisiaj jednak pokażemy Państwu, jak przygotować kolumnę ekstrakcyjną z kulkami krzemionkowymi.

Po wykonaniu tych czynności przepuszczamy lizat przez kolumnę krzemionkową; działa ona analogicznie do zestawów Qiagen stosowanych w laboratoriach w skali makro. Następnie przeprowadzamy płukanie, aby usunąć wszystkie niepożądane zanieczyszczenia, takie jak węglowodany, lipidy oraz inne składniki lizatu komórkowego i pozostałe elementy próbki ludzkiej. Na samym końcu przeprowadzamy elucję wodą.

Zaletą tych kolumn do mikroskalowej ekstrakcji w fazie stałej jest możliwość elucji przy użyciu bardzo małej ilości wody, zazwyczaj rzędu 1 do 5 µL. Pozwala to na odzyskanie niemal wszystkich wprowadzonych kwasów nukleinowych. Osiągamy wydajność na poziomie około 70 do 90% w pierwszych 10 µL odzyskiwanych z tego kanału.

Zatem, jeśli przepłuczemy układ dwukrotnie, używając 2 do 10 µL, odzyskamy niemal wszystkie wprowadzone kwasy nukleinowe. W efekcie otrzymujemy nie tylko czystą próbkę nadającą się do PCR, ale także próbkę o znacznie wyższym stężeniu, niż byłoby to możliwe przy użyciu standardowego zestawu laboratoryjnego. Nadrzędnym celem wszystkich tych technik przygotowania próbek jest uzyskanie wyników kompatybilnych z innymi pracami badawczymi.

Bardzo dobra praca w tej dziedzinie, wykazująca, że możliwe jest przeprowadzenie amplifikacji PCR na chipie. Reakcję odwrotnej transkrypcji można również przeprowadzić na chipie w przypadku pracy z wirusem RNA lub gdy planowane jest badanie ekspresji genów. Nasze techniki przygotowania próbek mogą być bezpośrednio sprzężone z PCR na chipie, dzięki czemu nie trzeba przeprowadzać oczyszczania ani przygotowania próbek przy stole laboratoryjnym.

Oraz krok zagęszczania, który byłby konieczny, aby uzyskać niewielkie objętości niezbędne do przeprowadzenia wielokrotnego PCR na małym chipie. Zatem eksperymenty, które zaprezentujemy dzisiaj, pokazują sposób montażu chipu mikrofluidycznego, który wykonany jest z termoplastiku, a nie z PDMS. W związku z tym wymagany jest nieco inny proces wytwarzania oraz uszczelniania tych chipów, niż stosuje się zazwyczaj.

Następnie przedstawimy sposób przeprowadzania chemii inicjowanej światłem wewnątrz chipa w celu wytworzenia monolitów polimerowych, które służą zarówno do lizy komórek, jak i do ekstrakcji w fazie stałej. Wynikiem tego procesu, który obecnie w laboratorium składa się z modułów, ale może zostać i został zintegrowany, jest uzyskanie wysoce skoncentrowanej próbki kwasów nukleinowych, RNA i DNA w wodzie. Próbka ta może następnie trafić do modułu PCR lub innego modułu amplifikacji, gdzie możliwe jest zidentyfikowanie mikroorganizmu lub infekcji. Obecnie realizujemy grant w ramach którego zaczynamy gromadzić próbki ludzkie z Boston Medical Center od pacjentów, którzy mogą być lub nie być zakażeni grypą typu A. Ponieważ trwa sezon grypowy, są to właśnie próbki, które obecnie zbieramy.

Następnie w laboratorium przeprowadzamy testy referencyjne (tzw. złoty standard), aby sprawdzić, czy dany pacjent jest zakażony grypą typu A, co w zasadzie polega na badaniu hodowlanym, którego wykonanie zajmuje kilka dni. Równocześnie poddajemy te same próbki analizie przy użyciu modułów naszego chipa. Przesyłamy je przez kolumnę lizującą, następnie przez kolumnę do ekstrakcji w fazie stałej, a na koniec przeprowadzamy reakcję PCR, aby ocenić skuteczność naszej metody w porównaniu z metodami referencyjnymi.

To jest etap, na którym obecnie się znajdujemy. Jeśli te eksperymenty zakończą się powodzeniem, myślę, że w ciągu najbliższych czterech do sześciu lat być może znajdziemy się w sytuacji, w której będziemy dysponować zintegrowanym chipem i pełnym testem w kierunku grypy A; pracujemy również nad Clostridium difficile i próbkami kału. Jesteśmy już bardzo blisko nie tylko integracji urządzenia, ale również integracji samego testu.

Zatem zarówno opracowanie testu, jak i projekt układu muszą przebiegać równolegle. W przypadku konkretnej aplikacji, mającej trafić do użytku przy łóżku pacjenta, jest to proces zorientowany na konkretny cel. Należy znać rodzaj analizowanej próbki oraz poszukiwany mikroorganizm, aby zoptymalizować układ pod kątem zastosowań przy łóżku pacjenta.

Więc uważam, że nie jesteśmy już tak daleko od realizacji tego w formie prototypu. Takie są nasze cele końcowe, więc mam nadzieję, że je osiągniemy.