Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura
23 maja 2025
Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.
Nasze badania koncentrują się na opracowywaniu wysokoprzepustowych, sterowanych obrazem, jednokomórkowych przepływów pracy spektrometrii mas MALDI w celu ujawnienia heterogeniczności komórkowej i powiązania profili molekularnych z tożsamością, funkcją i odpowiedzią komórek w złożonych systemach.
Zaawansowane oprzyrządowanie, takie jak MALDI-2 i spektrometry mas o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, umożliwiają ukierunkowaną, przestrzennie rozdzielczą analizę pojedynczych komórek, zwiększając czułość i rozszerzając zakres profilowania molekularnego w złożonych tkankach. Obecne wyzwania obejmują ograniczoną czułość, odtwarzalność próbek i złożoną analizę danych. Dane MALDI są często rzadkie, a duże zbiory danych z tysiącami komórek i setkami cząsteczek wymagają solidnych narzędzi obliczeniowych.
Protokół ten wypełnia lukę w wysokoprzepustowych metodach analizy pojedynczych komórek, a nawet organelli, umożliwiając bardzo szczegółowe badania heterogeniczności i uzyskanie wglądu w biologię i funkcję molekularną i komórkową.
Protokół ten umożliwia szybką, ukierunkowaną analizę komórek rozsianych po szkiełku, eliminując potrzebę manipulacji komórkami lub skanowania całego obszaru i znacznie zwiększając przepustowość.
[Narrator] Na początek przepłucz każde szkiełko dwoma do trzech mililitrów 150-milimolowego octanu amonu, aby usunąć kryształy glicerolu i soli, które mogą zakłócać mikroskopię i aplikację matrycy MALDI, a następnie wysusz szkiełka pod delikatnym strumieniem azotu lub pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu. Załaduj wysuszone szkiełko do stolika mikroskopu. Ustaw ostrość mikroskopu, używając co najmniej 10 punktów podparcia rozmieszczonych równomiernie na całym szkiełku. Korzystając z filtrów odpowiednich do DAPI i obrazowania w jasnym polu, uzyskaj kafelkowy obraz fluorescencyjny całego preparatu przy powiększeniu od 5 do 10 razy, zapewniając, że znaczniki odniesienia na szkiełkach mikroskopowych są wyraźnie uchwycone na obrazie. Zszyj kafelkowe obrazy za pomocą oprogramowania do mikroskopii, takiego jak ZEN ZEISS. Sprawdź, czy sąsiadujące pionowo kafelki nie są przesunięte. Przetwarzaj i eksportuj każdy zszyty obraz jako plik BigTIFF za pomocą oprogramowania mikroskopowego lub jako standardowy plik TIFF, jeśli ostateczny rozmiar obrazu jest mniejszy niż dwa gigabajty. Rozpuść 20 miligramów 2,5-dihydroksyacetofenonu w 1,5 mililitra acetonu. Umieść szkiełka w uchwycie komory sublimacyjnej, a następnie umieść uchwyt w aparacie sublimacyjnym. Odpipetować rozpuszczony roztwór matrycy na płytkę ceramiczną i pozwolić acetonowi całkowicie odparować, a następnie zamknąć komorę sublimacyjną, aby ją uszczelnić. Napełnij komorę chłodziwa błotem pośniegowym z lodowatej wody i umieść go bezpiecznie na komorze sublimacyjnej. Włącz pompę próżniową i pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez pięć minut. Rozpocznij sublimację od podgrzania komory do 200 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po pięciu minutach wyjmij lodowatą łaźnię wodną z komory. Ustaw temperaturę na 25 stopni Celsjusza i umieść radiator na górze komory. Powoli odpowietrz komorę sublimacyjną, aby uwolnić ciśnienie. Otwórz komorę i ostrożnie wyjmij szkiełka. Otwórz MicroMS i zdziesiątkuj obrazy mikroskopowe BigTIFF, korzystając z opcji grupy obrazów, aby uwzględnić zarówno kanały jasnego pola, jak i kanały fluorescencyjne. Przejdź do narzędzia Opcje obiektu blob i dostosuj maksymalny i minimalny rozmiar obiektu blob, aby zdefiniować dopuszczalny zakres rozmiarów obiektów blob. Ustaw próg kanału fluorescencji dla wykrywania plam. Określ wartość kołowości, aby określić, jak okrągłe muszą być zidentyfikowane komórki, aby można było wziąć pod uwagę, a następnie wybierz kolor. Użyj opcji Znajdź obiekt blob, aby wykryć obiekty blob. Po wyświetleniu monitu zapisz listę obiektów blob pod żądaną nazwą. Użyj narzędzia Filtr odległości, aby ustawić minimalną odległość między każdą komórką. Przetestuj błąd za pomocą punktów testowych, aby dokładnie określić błąd przesunięcia. Załaduj szkiełka do instrumentu za pomocą adaptera suwaka MTP II. Po powrocie do komputera z MicroMS uzyskaj dostęp do komputera ze spektrometrem mas za pomocą aplikacji na zdalny pulpit. Jeśli używasz instrumentu po raz pierwszy, sprawdź jego pozycję, przechodząc do Narzędzia, a następnie Ustawienia instrumentu. W oknie podręcznym wyświetl zestaw współrzędnych wraz z ich położeniami X i Y, a następnie wybierz każdy z tych konkretnych punktów na geometrii adaptera suwakowego II. Zaktualizuj pozycje X i Y w oknie MicroMS. Korzystając z kamery spektrometru mas i elementów sterujących spektrometru, przejdź do łatwego do zidentyfikowania miejsca na szkiełku i skopiuj współrzędne instrumentu. W MicroMS zlokalizuj tę samą pozycję na obrazie mikroskopu, kliknij prawym przyciskiem myszy i wprowadź współrzędne do wyskakującego okienka. Zaokrąglij współrzędne do najbliższych liczb całkowitych i oddziel je spacją. Po dodaniu trzech punktów rejestracyjnych, jedno z kółek zmieni kolor na czerwony, wskazując, że jest to najbardziej odległa pozycja od rejestracji. Usuń punkt rejestracji za pomocą Control + kliknij prawym przyciskiem myszy i spróbuj ponownie. W obszarze Plik przejdź do pozycji Zapisz, a następnie Rejestracja, aby zapisać plik rejestracyjny. Gdy plamy są widoczne na slajdzie, przejdź do Plik, Zapisz, a następnie pozycje instrumentu, aby zapisać plik pozycji instrumentu, a następnie za pomocą oprogramowania pulpitu zdalnego przenieś ten plik na komputer instrumentu. Otwórz niestandardowy plik XEO i skopiuj jego zawartość do adaptera suwaka MTP II . XEO na komputerze instrumentu. Zapisz plik, aby zaktualizować ten plik geometrii o lokalizacje komórek. Kliknij kartę Automatyzacja i wybierz opcję Nowy, aby utworzyć nowy przebieg automatyczny. Przeciągnij wskaźnik myszy przez wyświetlony obszar próbki, aby zaznaczyć komórki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać je do listy analizy. Zapisz przebieg automatyczny i kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie automatyczne, aby rozpocząć pobieranie. Rysunek ten ilustruje, w jaki sposób profilowanie spektrometrii mas MALDI-2 w pojedynczej komórce ujawnia heterogeniczność komórkową opartą na lipidach w różnych regionach mózgu i w ich obrębie. Jednorodne przybliżenie i projekcja rozmaitości lub analiza UMAP rozdzieliły komórki według regionu mózgu, tworząc odrębne klastry dla prążkowia, hipokampa i kory. Grupowanie w Lejdzie ujawniło cztery subpopulacje komórek oparte na lipidach. Ponadto zaobserwowano sygnatury lipidowe specyficzne dla klastrów, z różnymi profilami intensywności w lipidach z adnotacjami. Widma masowe z sześciu komórek korowych również wykazały spójne wykrywanie lipidów na wszystkich szkiełkach. Co więcej, komórki korowe z różnych slajdów wykazywały nakładające się rozkłady UMAP, co wskazuje na minimalne efekty wsadowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykorzystania microMS do fluorescencyjnie kierowanej spektrometrii mas MALDI-2 w pojedynczych komórkach, co pozwala na ulepszenie profilowania molekularnego pierwotnych komórek neuronalnych szczura. Celem badań jest rozwiązanie problemu heterogeniczności komórkowej oraz powiązanie profili molekularnych z tożsamością i funkcją komórek w obrębie złożonych tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Spektrometria mas
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Wysokoprzepustowe przepływy pracy z obrazowaniem ułatwiają badania nad heterogenicznością komórkową.
- Zaawansowana spektrometria mas MALDI-2 umożliwia analizę z rozdzielczością przestrzenną.
- Obecne wyzwania obejmują analizę danych oraz problemy z czułością.
- W przypadku dużych zbiorów danych niezbędne są niezawodne narzędzia obliczeniowe.
Cel badania
- Udoskonalić wysokoprzepustowe metody analizy pojedynczych komórek.
- Powiązać dane molekularne z tożsamością i funkcją komórkową.
- Pogłębić wiedzę na temat biologii złożonych układów nerwowych.
Zastosowane metody
- Protokół wykorzystuje spektrometrię mas MALDI-2 pojedynczych komórek do analizy.
- Główny model składa się z pierwotnych komórek neuronalnych szczura.
- Kroki obejmują przygotowanie szkiełek, sublimację matrycy oraz analizę plam (blob analysis) w celu detekcji komórek.
- Kluczowe są szczegółowe pozyskiwanie obrazów mikroskopowych oraz rejestracja obliczeniowa.
- Przetwarzanie danych obejmuje specjalistyczne oprogramowanie służące do ulepszania wyników spektrometrii mas.
Główne wyniki
- Wykazano heterogeniczność komórkową opartą na lipidach w różnych obszarach mózgu.
- Analiza UMAP pozwoliła na skuteczne pogrupowanie komórek według regionów mózgu.
- Zidentyfikowano specyficzne dla klastrów sygnatury lipidowe, co podkreśliło odrębne profile komórkowe.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szybką i ukierunkowaną analizę komórek neuronalnych bez konieczności przeprowadzania rozległych manipulacji.
- Uzyskane wyniki pozwalają na lepsze zrozumienie biologii molekularnej i komórkowej w neuronaukach.
- Wnioski z przeprowadzonych badań mogą być wykorzystane w przyszłych studiach nad funkcjami komórkowymi w tkankach złożonych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokoprzepustowa spektrometria mas MALDI-2 z prowadzeniem fluorescencyjnym umożliwia precyzyjne profilowanie molekularne poszczególnych komórek neuronów, rozwiązując problem heterogeniczności komórkowej w złożonych tkankach. Ten schemat pracy zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkryć poprzez powiązanie sygnatur molekularnych z tożsamością i funkcją komórek. Podejście to wspiera decyzje dotyczące portfolio, dostarczając skalowalnych i powtarzalnych danych z pojedynczych komórek, które są kluczowe dla walidacji celów i redukcji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej i mapowanie szlaków molekularnych w rozdzielczości pojedynczych komórek.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez korelację profili molekularnych z tożsamością komórek i biologią specyficzną dla danego regionu.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów dzięki rzetelnym, wysokotreściowym danym molekularnym.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy jednokomórkowe do późniejszych etapów wysokoprzepustowych analiz przesiewowych.
- Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki molekularne odpowiednie do standaryzacji testów.
- Zmniejsza objętość danych i zwiększa przepustowość poprzez celowanie wyłącznie w lokalizacje komórek, optymalizując gotowość do analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje profilowanie molekularne z istotnymi dla choroby systemami neuronalnymi w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wspieranie powtarzalności między preparatami i regionami.
- Umożliwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki szczegółowej analizie subpopulacji komórkowych opartej na lipidach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces od wczesnego etapu odkrywania po identyfikację związku wiodącego, wspierając zarówno testowanie hipotez, jak i badania translacyjne w neuronauce oraz dziedzinach pokrewnych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia badanie różnorodności komórek neuronalnych i funkcji molekularnych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków w kontekście pojedynczych komórek.
- Analityka: Dostarcza wysokotreściowe, rozdzielone przestrzennie pomiary molekularne do rzetelnej analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i walidację modeli przedklinicznych przy minimalnym efekcie serii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia skalowalny, wielokrotnego użytku schemat pracy dla profilowania molekularnego pojedynczych komórek w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechaniczną w walidacji celów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wysokoprzepustową, powtarzalną analizę pojedynczych komórek przy zmniejszonym obciążeniu danymi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie solidnych danych molekularnych z wielu próbek.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie zaawansowanej spektrometrii mas i mikroskopii fluorescencyjnej.
- Wymaga dostępu do aparatury MALDI-2 oraz infrastruktury obliczeniowej do analizy danych.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w zakresie rejestracji obrazów i przetwarzania danych.
- Metoda jest możliwa do zastosowania w różnych systemach komórek neuronalnych i potencjalnie nieneuronalnych, po przeprowadzeniu odpowiedniej walidacji.
- Złożoność analizy danych oraz powtarzalność między próbkami są kluczowymi kwestiami praktycznymi.
