Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Protokół ten oferuje prosty, skuteczny i powtarzalny system transformacji phytophthora palmivora i phytophthora capsici. Na początek weź nową płytkę LB auger z antybiotykiem. Dodaj 20 mikrolitrów płynnego medium LB do środka płyty i nabierz komórki agrobakterii z wcześniej wyhodowanej płyty sterylną rurką mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Używając dna i płaskiej podstawy rurki, rozłóż komórki równomiernie na płytce. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez około 16 do 18 godzin. Następnie wyczyść komórki agrobakterii hodowane przez noc za pomocą pipety o jednym mililitrze.

Ponownie zawiesij komórki w jednym mililitrze pożywki indukcyjnej agrobakterii, pipetując w górę i w dół. Następnie przenieś ponownie zawiesowane komórki do sterylnej rurki o pojemności 50 mililitrów pokrytej folią i dodaj pożywkę indukcyjną agrobakterii. Zmierz gęstość optyczną próbki na 600 nanometrów i rozcieńcz ją za pomocą ośrodka indukcyjnego agrobakterii, aby uzyskać gęstość optyczną 0,4.

Następnie poluzuj pokrywkę rurki pokrytej folią, zawierającej zawiesinę bakteryjną. Umieść go na platformie z delikatnym poruszeniem z prędkością około 70 obrotów na minutę. Zalać siedmio- do ośmiodniową płytkę phytophthora palmivora 10 mililitrami wody wstępnie schłodzonej do czterech stopni Celsjusza.

Użyj końcówki pipety, aby delikatnie stukać w powierzchnię i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika. Inkubuj płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przelej go do temperatury pokojowej pod światłem na kolejne 15 minut.

Za pomocą pipety delikatnie przelej około siedmiu do ośmiu mililitrów uwolnionych zoospor do sterylnej rurki wirówki o pojemności 15 mililitrów, nie naruszając grzybni i sporangów. Następnie przelej 20 mikrolitrów zawiesiny zoospory do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 180 mikrolitrów wody, aby rozcieńczyć zawiesinę dziesięciokrotnie. Wykonaj przez minutę wir w rurce, aby wykupić zoospory, i użyj hemocytometru pod mikroskopem, by je policzyć.

Dodaj pięć mililitrów przygotowanej zawiesiny agrobakterii do pięciu mililitrów zawiesiny zoospory w sterylnej rurce pokrytej folią o pojemności 50 mililitrów. Delikatnie wymieszaj zawartość, odkręć pokrywkę tubki i pozostaw w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Podczas inkubacji przygotuj płytki AZCA.

Gdy podłoże się zastygnie, umieść na niej jeden kawałek sterylizowanej membrany Hybond-N+, a płytę trzymaj w ciemności. Po dwóch godzinach współinkubacji użyj końcówki pipety, aby rozprowadzić 300 mikrolitrów mieszaniny na membranę Hybond-N+, zapewniając, że marginesy są wolne od cieczy. Zostaw odkryte szalki Petriego w kapturze na około 10 minut, aby mieszanka mogła wyschnąć na powietrzu.

Gdy ciecz przestanie się poruszać po błonie, zakryj płytki. Inkubuj przykryte płyty w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez dwa dni. Po 48 godzinach inkubacji użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść membranę Hybond-N+ do góry nogami na płytę ślimaka Plich bez przeciągania jej po powierzchni ślimaka.

Użyj płaskiej podstawy rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra, aby delikatnie naciskać i przesuwać się po powierzchni membrany, zapewniając pełny kontakt z nośnikiem. Sprawdź spód płyty pod kątem pęcherzyków powietrza i delikatnie wyciśnij ją tą samą płaską podstawą. Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w 12-godzinnym świetle i 12-godzinnym cyklu ciemności przez dwa do trzech dni.

Na koniec, po dwóch do trzech dniach inkubacji, usuń błonę za pomocą sterylnych kleszczy i kontynuuj inkubację płytki w tych samych warunkach światła i temperatury. Współinkubacja zoospor phytophthora palmivora z agrobakterią tumefaciens EHA 105 ekspresującą pCB301TOR-GFP dała kolonie odporne na G418 na ślimaku Plich z dodatkiem 30 mikrogramów na mililitr G418, podczas gdy na płytach kontrolnych nie pojawiły się kolonie bez infekcji agrobakterią. Liczba transformantów odpornych na G418 na 10 do zoospor o mocy siedmiu wynosiła 55 w eksperymencie pierwszym i 50 w eksperymencie drugim.

Mikroskopia fluorescencyjna potwierdziła wyraźny sygnał białka fluorescencyjnego w transformantach phytophthora palmivora. Dodatkowo ten protokół został zastosowany do phytophthora capsici, aby skutecznie generować transformanty ekspresyjne GFP. Nasz protokół pozwala badaczom badać funkcje genów, określać lokalizację komórek białek oraz śledzić dynamikę infekcji patogenem.

Protokoły te mogą generować niski procent fałszywie pozytywnych wyników, dlatego wymagają dodatkowych podejść do potwierdzenia prawdziwych transformantów. Zastosowanie tego systemu transformacji można rozszerzyć na inne oomycety i grzyby. W przyszłości będziemy również starać się jeszcze bardziej uprościć ten protokół.