Efektywna transformacja mchu Physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (PEG)
19 kwietnia 2011
Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physocmitrella oraz protoplastów mezofilu Arabidopsis1.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest transformacja protoplastów SCO Metre. Jest to realizowane poprzez wstępne trawienie roślin za pomocą Drizly. Następnie protoplasty są płukane mannitolem w celu usunięcia Drizly, a następnie inkubowane z DNA i peg.
Na koniec przekształcone protoplasty roznosi się na płytki i inkubuje. W rezultacie można uzyskać obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, ukazujące przekształcone protoplasty wykazujące ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie. Procedurę tę zademonstruje Y lu, postdoc z mojego laboratorium.
Główną zaletą tej techniki jest jej skuteczność oraz powtarzalność w generowaniu protoplastów wykazujących ekspresję białka zainteresowania. Aby wyizolować protoplasty mchu, należy rozpocząć od dodania szpatułką dziewięciu mililitrów 8% mannitolu do szalki Petriego. Następnie do mannitolu należy przenieść mch z dwóch do trzech płytek PP NH 4 w wieku od pięciu do siedmiu dni. Przepis przygotowania tego oraz dodatkowych odczynników znajduje się w załączonym protokole pisemnym. Następnie należy dodać trzy mililitry 2% drisly i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, delikatnie wstrząsając.
Przefiltruj mieszaninę przez sito o oczkach 100 micron, aby uzyskać zieloną, jednorodną zawiesinę. Następnie wiruj filtrat z prędkością 250 G przez pięć minut. Bardzo ostrożnie odlej nadsącz.
Resuspendować protoplasty w 500 µL 8% mannitolu. Następnie dodać kolejne 9,5 ml 8% mannitolu. Upewnić się, że protoplasty są w pełni zawieszone.
Powtórz etapy płukania jeszcze dwa razy, ponownie wirując roztwór przy 250 G przez pięć minut. Odlej supernatant i ponownie zresuspenduj protoplasty, najpierw w 500 µL.
Następnie należy dodać 9,5 mililitrów 8% mannitolu, korzystając z cytometru hematologicznego. Należy policzyć liczbę protoplastów w 10 mikrolitrach zawiesiny, aby wprowadzić DNA do wyizolowanych protoplastów. W pierwszej kolejności należy odwirować mieszaninę protoplastów przy 250 G przez pięć minut.
Usunąć supernatant i resuspendować protoplasty w roztworze MMG do stężenia 1,6 miliona na mililitr. Inkubować zawiesinę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie dodać 600 µL roztworu protoplastów do probówki z hodowlą zawierającej 60 µg DNA. Wstrząsnąć.
Ostrożnie dodaj 700 µL roztworu PEG z wapniem i wymieszaj. Przez ten czas inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przykryj płytki PRMB folią celofanową.
Następnie rozcieńczyć zawiesinę trzema mililitrami roztworu W5 i wirować przy 250 G przez pięć minut. Aby usunąć PEG, resuspender protoplasty w dwóch mililitrach PRMT i wysiać jeden mililitr na płytkę PRMB przykrytą celofanem. Przechowywać płytki w temperaturze 25 °C w komorze wzrostowej.
Wreszcie, cztery dni po transformacji, przenieś celofan na świeże płytki selekcyjne. Rysunek ten przedstawia przykład 18-dniowych roślin zregenerowanych z protoplastów, które poddano transformacji 15 µg superzwiniętego plazmidowego DNA zawierającego kasetę oporności na hygromycynę. W tym przypadku do protoplastów wprowadzono 30 µg tego samego superzwiniętego plazmidowego DNA.
W tej próbce przeprowadzono transformację za pomocą 60 µg kolistego DNA. Ostatecznie rośliny te zregenerowano z protoplastów, które poddano transformacji 120 µg tego samego superzwiniętego plazmidowego DNA zawierającego kasetę oporności na hygromycynę. Wydajność transformacji nie zmienia się przy stężeniach DNA do 60 µg.
Jednakże wyższe stężenia DNA są niekorzystne dla tej procedury. Dane wskazują, że metoda ta dostarcza spójnych wyników w szerokim zakresie ilości DNA w ciągu jednego semestru. Technika ta może zostać przeprowadzona w trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody, takie jak przejściowe RNAi oraz nokaut genów, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące funkcji genów.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella patens. Technika ta została opracowana na podstawie istniejących protokołów transformacji protoplastów i ma na celu uzyskanie powtarzalnych, pomyślnych wyników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Inżynieria genetyczna
- Biologia komórki
Wstęp
- Protoplasty to komórki roślinne pozbawione ścian komórkowych.
- Techniki transformacji są niezbędne do badania funkcji genów u roślin.
- Physcomitrella patens służy jako organizm modelowy w badaniach nad roślinami.
- Istniejące metody transformacji protoplastów mogą być skomplikowane i czasochłonne.
Cel badania
- Aby dostarczyć usprawniony protokół transformacji protoplastów Physcomitrella patens.
- Aby zwiększyć wydajność i niezawodność transformacji protoplastów.
- Aby ułatwić dalsze badania genetyczne nad mchem.
Zastosowane metody
- Trawienie tkanki mchu za pomocą Drizly w celu izolacji protoplastów.
- Przemywanie protoplastów mannitolem w celu usunięcia zanieczyszczeń.
- Transformacja wyizolowanych protoplastów DNA przy użyciu PEG.
- Inkubacja transformowanych protoplastów na pożywkach selekcyjnych.
Główne wyniki
- Przetransformowane protoplasty skutecznie wyekspresowały białka fluorescencyjne.
- Metoda wykazała spójną wydajność transformacji przy różnych stężeniach DNA.
- Stwierdzono, że wyższe stężenia DNA działają niekorzystnie na powodzenie transformacji.
- Cała procedura może zostać ukończona w ciągu około trzech godzin.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do transformacji protoplastów Physcomitrella patens.
- Umożliwia ona przeprowadzanie kolejnych eksperymentów, takich jak przejściowe RNAi oraz nokauty genów.
- Protokół ten może znacząco pomóc w zrozumieniu funkcji genów u mchów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Transformacja protoplastów Physcomitrella patens za pomocą PEG umożliwia wydajną i powtarzalną dostawę genów, wspierając wysokoprzepustową genomikę funkcjonalną w systemach roślinnych. Możliwość ta jest kluczowa dla zespołów zajmujących się wczesną fazą odkrywania, dążących do zbadania funkcji genów, walidacji celów oraz przyspieszenia wyjaśniania szlaków sygnałowych w modelu podatnym na modyfikacje genetyczne. Skalowalność i potencjał standaryzacji tej metody sprawiają, że jest ona cenna w kontekście screeningu genetycznego w całym portfolio oraz redukcji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybką analizę funkcji genów poprzez efektywne dostarczanie DNA do komórek mchu.
- Wspiera wysokoczęstotliwościowe celowanie genowe w celu funkcjonalnej walidacji celów oraz analizy szlaków.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie precyzyjnych modyfikacji genetycznych w systemie modelowym.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do późniejszych hipotez biologicznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany protokół generowania dużej liczby transformantów do testów przesiewowych.
- Gwarantuje powtarzalną wydajność transformacji, wspierając niezawodność i skalowalność testów.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do oceny związków i przesiewu fenotypowego.
- Zmniejsza zależność od specjalistycznego sprzętu, zwiększając dostępność dla zespołów opracowujących testy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia prowadzenie dalszych analiz, takich jak przejściowe RNAi oraz badania nad knockoutem genów w kontekście modelowania chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkrywania genów po walidację przedkliniczną w systemach roślinnych.
- Stanowi platformę do poszukiwania biomarkerów translacyjnych w przypadku powiązania z szlakami istotnymi dla danej choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół transformacji wpisuje się w kontinuum od wczesnego etapu odkrywania do identyfikacji wiodących związków, umożliwiając manipulacje genetyczne, walidację celów oraz opracowywanie testów w modelach roślinnych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez efektywne dostarczanie genów oraz analizę ich ekspresji.
- Przesiewy: Wspiera gotowość i powtarzalność testów poprzez generowanie jednolitych populacji transformantów.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych, takich jak wydajność transformacji i poziom ekspresji białek, do celów analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Umożliwia prowadzenie badań genetycznych, które stanowią podstawę do opracowywania modeli przedklinicznych i identyfikacji biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Oferuje szeroko stosowalną, znormalizowaną możliwość transformacji dla różnorodnych badań genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w procesach transformacji genetycznej.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu generowania wiarygodnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów genetycznych i szlaków sygnałowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli komórkowych roślin oraz technik sterylnych w celu izolacji i transformacji protoplastów.
- Niezbędny jest dostęp do podstawowej infrastruktury laboratoryjnej, w tym do wirówki i mikroskopii fluorescencyjnej w celu walidacji wyników.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów transformacji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności w różnych projektach.
- Może być wymagana adaptacja metody do zastosowania u innych gatunków roślin lub w innych systemach modelowych poza Physcomitrella patens.
- Wydajność transformacji jest zależna od stężenia DNA, przy czym większe ilości mogą być szkodliwe.
