Badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Jeśli są one skutecznymi transmiterami wirusów roślinnych, a w przypadku mikroiniekcji wirusa, procedura, którą zaprezentujemy dzisiaj, jest techniką pozwalającą badaczom na wstrzykiwanie wirusa bezpośrednio do hemocytów AFib, z pominięciem jelita, które jest jedną z dwóch głównych barier dla transmisji wirusa w sposób cyrkulacyjny. Cześć, jestem Cecilia Tamrin Dehi, postdoc w katedrze patologii roślin na Uniwersytecie Cornella. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wstrzyknąć wirusa do hemocytów AFI, co umożliwi jego późniejszą transmisję na różne gatunki roślin.

Na przykład, ta roślina FE jest zainfekowana wirusem PLRV (wirusa zwijania liści ziemniaka). Można zauważyć różnicę między rośliną zdrową a zainfekowaną. Najbardziej charakterystycznym objawem jest stwardnienie tkanki.

PLRV jest wirusem luteowym przenoszonym przez mszyce w ich hemolimfie, która jest odpowiednikiem krwi ssaków u owadów. Gdy niezarażona mszyca żywi się zainfekowaną rośliną, zaraża się wirusem poprzez soki roślinne, co można zobaczyć tutaj. Po połknięciu wirus musi przedostać się z jelita owada do hemolimfy, a następnie przejść przez gruczoły ślinowe, aby zostać ponownie przeniesionym na roślinę ESE.

Nawet jeśli podczas żerowania na roślinie ESE wirusy mogą zostać pobrane w dużej ilości, tylko część z nich przedostanie się przez jelita i gruczoły ślinowe. Są to dwie główne bariery utrudniające transmisję i infekowanie kolejnych roślin testowych. Jeśli mszyca jest niezdolna do przenoszenia wirusa, karmimy ją zainfekowaną tkanką przez dwa dni, a następnie pozwalamy jej żerować na zdrowej roślinie przez pięć dni.

Następnie roślinę poddaje się fumigacji, a po trzech tygodniach rozpoczynamy poszukiwanie objawów. Gdy znajdziemy osobnika AFib, który nie jest w stanie przenieść wirusa, możemy ocenić, która z dwóch barier powstrzymuje wirusa, stosując procedurę mikroiniekcji, którą zaprezentuję dzisiaj. W tej procedurze wirus jest wstrzykiwany bezpośrednio do hemocytów, z pominięciem bariery transmisji jelitowej.

Zacznijmy zatem; pokażę Państwu, jak przeprowadzić mikroiniekcję wierzchołków. Oto szklane igły, których używamy. Przygotowujemy je, wyciągając z tych szklanych kapilar przy użyciu urządzenia APU.

Oto mikroinjektor służący do mikroiniekcji wirusa. Rozpocznę od umieszczenia igły w uchwycie na igłę.

Wkładam igłę i umieszczam ją na miejscu. Teraz załaduję wirusa do igły, aż do górnej części tego elementu. Teraz musimy ustawić AFI do mikroiniekcji.

Więc wezmę mszyce za pomocą zapodawacza i umieszczę ją w uchwycie do mszyc. Idealnie byłoby spróbować przycisnąć grzbiet mszycy do uchwytu, aby mieć dostęp do części brzusznej owada. Dobrze, świetnie.

Teraz możemy przystąpić do mikroiniekcji. Dobrze, teraz ustawię igłę i przybliżę ją do AFib. Następnie dotknę igłą AFib; aby przebić egzoszkielet, najlepiej spróbować wbić ją pomiędzy segmenty u podstawy odnóży.

Przystępuję do iniekcji. Pobieram teraz AFI za pomocą pędzelka i przenoszę do papieru regeneracyjnego, gdzie pozostawię go na chwilę. Musimy również wykonać mikroiniekcję kontrolnego AFI.

Ta kontrolna mikroiniekcja jest wykonywana wyłącznie z użyciem buforu, bez wirusa. Stosowany przez nas bufor to 0.1 M bufor fosforanowy o pH 7. Umieszczę agrifiltr w zdrowej roślinie, w której pozostawię go na pięć dni; następnie zasilę roślinę i będę oczekiwać na rozwój objawów. Po mikroiniekcji jednoniciowego RNA, każdego dnia przez tydzień, mierzy się poziom ekspresji genu docelowego w agrifiltracie.

Właśnie przeprowadziliśmy mikroiniekcję u mszycy, która nie była w stanie przenosić wirusa. Jeśli po mikroiniekcji mszyca ta będzie mogła przenosić wirusa, będzie to oznaczać, że posiada ona barierę jelitową, która blokowała wirusa. Jeśli natomiast nie rozwiną się żadne objawy, będzie to oznaczać, że mszyca ta posiada silną barierę w gruczołach ślinowych.

W ten sposób pokazaliśmy, jak mikroiniekcyjnie wprowadzać wirusa do mszyc. Ta sama procedura jest wykorzystywana do mikroiniekcji dwuniciowego RNA do mszyc w celu przeprowadzenia interferencji RNA (RNAi), która jest interesującą techniką pomagającą w badaniu funkcji genów u mszyc. To wszystko w kwestii mikroiniekcji.

Mam nadzieję, że materiał okaże się przydatny i pomoże Państwu w prowadzeniu eksperymentów. Dziękuję.