Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Przygotowanie komórek dendrytycznych z szpiku kostnego stanowi doskonałe źródło komórek prezentujących antygen, które mogą być wykorzystywane w eksperymentach in vitro lub in vivo w obrazowaniu układu odpornościowego w dwóch płaszczyznach. Wprowadzenie komórek prezentujących antygen umożliwia badanie specyficznych dla antygenu interakcji międzykomórkowych w kontekście żywego węzła chłonnego. W niniejszym materiale prezentujemy metodę sterylnej izolacji szpiku kostnego oraz techniki hodowli służące do produkcji dojrzałych komórek dendrytycznych.

Ponadto śledzimy rozwój komórek dendrytycznych od pierwszego do jedenastego dnia. Rozwój ten przedstawiono na zdjęciach oraz w filmach z inkubatora wykonanych przy użyciu systemu IncuSite firmy Scent Technologies. Na koniec prezentujemy pochodzące z szpiku kostnego komórki dendrytyczne prezentujące antygen cove limfocytom T OT-II w drenażowym węźle chłonnym.

Cześć, jestem Melanie Matthew z laboratorium Micah Halena na pobliskim Uniwersytecie Kalifornijskim. Czy zastanawialiście się kiedyś, co dzieje się wewnątrz podczas proby, gdy Wasze komórki rosną? Dzisiaj?

W ramach naszego protokołu pokażemy Państwu, jak korzystać z niektórych instrumentów w miejscu badania. System inky umożliwia monitorowanie wzrostu kultur komórkowych w inkubatorze. W tym protokole pokażemy Państwu, jak izolować i przygotowywać komórki grupowe pochodzące z szpiku kostnego myszy.

W pierwszej kolejności pokażę Państwu, jak usunąć kości udowe i wyizolować szpik kostny. Najpierw należy przymocować zwierzę szpilkami. Następnie zwilżyć zwierzę 70% ethanol. Wykonać pierwsze nacięcie wzdłuż linii środkowej ciała zwierzęcia.

Następnie wykonaj cięcie wewnątrz nogi, tak jak tutaj pokazuję. Aby odsłonić tkankę mięśniową nad kością udową, należy odsunąć mięsień i chwycić dużą kość udową pęsetą anatomiczną. Trzymając kość pęsetą, przesuń się wzdłuż niej i wykonaj pierwsze cięcie tuż poniżej stawu.

Następnie prowadź nożyczki wzdłuż kości udowej i wykonaj cięcie jak najbliżej ciała. Może to spowodować niewielki krwawienie, szczególnie w przypadku przecięcia tętnicy udowej. Podczas usuwania kości udowej niezwykle ważne jest, aby kość pozostała nienaruszona.

Jak widać, końce kości nie zostały przecięte ani uszkodzone. Po usunięciu kości udowej należy odciąć wszelkie dodatkowe tkanki i umieścić kość udową w małym naczyniu z naszymi mediami PMI. Podczas usuwania dodatkowych tkanek należy dopilnować, aby kość udowa nie wyschła.

Na tym etapie kości udowe należy przenieść do naczynia zawierającego 70% etanol i umieścić na lodzie na okres od pięciu do 10 minut. Na potrzeby tego filmu będziemy kontynuować pracę na blacie laboratoryjnym. Jednak na tym etapie eksperymentu wszystkie czynności powinny być wykonywane w dygestorium do hodowli tkankowej.

Po namoczeniu kości w etanolu można je przenieść do większego naczynia z jałową pożywką w celu usunięcia szpiku kostnego. Teraz możemy przystąpić do usunięcia i resuspensji szpiku kostnego. Napełnij strzykawkę insulinową jałową pożywką i odstaw ją na bok do późniejszego użycia.

Chwyć kość za pomocą sterylnej pęsety. Trzymaj ją nad małym naczyniem na odpady i odetnij nasadę lub końce kości z każdej strony. Wprowadź strzykawkę insulinową do jednego z końców kości i wypłucz szpik do 15 ml pożywki.

Przemyj kość jeszcze jeden lub dwa razy, aż cały szpik zostanie wypłukany. Po wypłukaniu szpiku z kości będzie ona niemal całkowicie biała. Umieść czystą kość w naczyniu na odpady i powtórz cały proces dla drugiej kości udowej.

Po zakończeniu tego etapu delikatnie rozbij wszelkie fragmenty szpiku, które nie rozpadły się podczas procesu płukania, aby uzyskać jednorodne zawiesiny pojedynczych komórek. Wymaga to pipetowania przez okres od 5 do 10 minut. Przenieś zawiesinę pojedynczych komórek do stożkowej probówki 50 ml, a płytkę wypłucz co najmniej trzy razy, używając 10 ml pożywki.

Za każdym razem odwirować komórki, usunąć medium i resuspender komórki, energicznie i szybko pocierając palcami dno probówki. Aby usunąć erytrocyty (RBC), przeprowadza się lizę wodną. Inną metodą usuwania erytrocytów jest liza chlorkiem amonu.

Obie metody zostały opisane w poprzednich artykułach wideo JoVE. Izolacja limfocytów T CD4+ z węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem systemu Miltenyi Biotec (JoVE, numer 9) oraz przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T z cytokin szczurzych (JoVE, numer 10).

Po usunięciu erytrocytów można przystąpić do hodowli komórek. Zanim jednak omówię hodowlę komórek dendrytycznych, chciałbym przedstawić Państwu system Incucyte. System Incucyte umożliwia monitorowanie wzrostu hodowli komórek wewnątrz inkubatora, dzięki czemu możemy obserwować, jak komórki zachowują się w warunkach hodowli.

Po przygotowaniu hodowli należy umieścić ją w tacy o odpowiednim rozmiarze i zamknąć system IncuCyte. Następnie w komputerze wystarczy ustawić odstępy czasowe, wybrać studzienki, które mają zostać zobrazowane, i pozwolić systemowi IncuCyte na zbieranie danych. Filmy w niniejszym protokole obrazują zmiany morfologii komórek dendrytycznych in vitro.

Filmy te zostały wyeksportowane bezpośrednio z programu witryny Incus. W miarę rozwoju komórek dendrytycznych od pierwszego do jedenastego dnia można zaobserwować rzeczywistą zmianę morfologii, gdy komórki powiększają się i przyjmują fenotyp komórki dendrytycznej. Po lizie i usunięciu RBC, komórki są przemywane w pożywce dla pierwotnych komórek dendrytycznych i wysiewane w zagęszczeniu 5 milionów na ml.

Komórki te powinny być początkowo hodowane w pożywce do pierwotnych kultur komórek dendrytycznych, a następnie przeniesione do wtórnej pożywki dla komórek DC, uzupełnionej o 40 ng/ml IL-4 oraz 100 ng/ml TNF-α. Cytokiny te wspomagają powstawanie dojrzałych komórek dendrytycznych, które przypominają komórki dendrytyczne pochodzenia monocytarnego. Teraz pokażę Państwu, jak wyglądają kultury w miarę ich rozwoju oraz jak utrzymywać je w czasie.

Po wysianiu komórek można hodować komórki dendrytyczne przez 72 godziny przed pierwszą wymianą pożywki. Oto jak wygląda typowa hodowla tuż po wysianiu komórek w pierwszym dniu. A tutaj przedstawiamy widok komórek.

W trzecim dniu można zauważyć, że komórki zaczęły przylegać do płytki, ale nie przyjęły jeszcze klasycznego fenotypu komórek dendrytycznych. W czwartym dniu należy usunąć medium i dodać 10 ml świeżego medium do pierwotnych DC poprzez aspirację medium. W czwartym dniu usuniemy limfocyty oraz wszelkie inne komórki nieprzylegające.

Teraz można umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze na kolejne trzy dni, siedem dni po pierwotnym wysianiu. Oto jak wygląda typowa hodowla. W tym momencie można stwierdzić, że nadszedł czas na pasaż i ponowne wysianie komórek.

Siódmego dnia komórki dendrytyczne usuwa się z płytki poprzez odessanie pożywki, a następnie dodanie 300 mM sterylnego EDTA i inkubację przez pięć minut. Następnie płytkę wielokrotnie płucze się, trzymając ją pod kątem 45 stopni i pipetując roztwór EDTA o tylną ściankę płytki. Czynność tę powtarza się przez kilka minut, aby upewnić się, że usunięto wszystkie przylegające komórki dendrytyczne.

Komórki zbiera się do 50 ml probówki stożkowej i przemywa dwukrotnie pożywką DC secondary. Następnie komórki resuspenduje się i wysiewa w zagęszczeniu 5 milionów komórek na płytkę. Świeżo wysiane siódmego dnia komórki dendrytyczne szybko opadają na dno płytki, przylegają i zaczynają się rozpłaszczać.

Jak widać na filmie z witryny Zichy, nagranie to zostało wykonane w inkubatorze w ciągu dwóch dni, aby zaprezentować rozwój komórek dendrytycznych od momentu ponownego wysiania w siódmym dniu do początku dziewiątego dnia. Morfologiczne komórki dendrytyczne mogą zostać aktywowane poprzez puls antygenowy z dodatkiem 2 µg/mL LPS oraz 100 µg/mL OVA do użycia z oczyszczonymi limfocytami T z myszy OT-II, które posiadają swoiste dla OVA limfocyty T CD4+. W przypadku stosowania innego antygenu ważne jest upewnienie się, że do pulsowania komórek dendrytycznych użyto optymalnego stężenia antygenu. Tutaj OVA i LPS są dodawane do pożywki podstawowej w taki sposób, aby końcowe stężenie LPS wynosiło 2 µg/mL w 20 mL, a OVA 100 µg/mL w 20 mL.

Oto fotografia przedstawiająca typową hodowlę komórek dendrytycznych w 10. dniu. Na zdjęciu widać, że morfologia jest bardzo charakterystyczna dla komórki prezentującej antygen. Należy zawsze sprawdzać procentowy udział komórek dendrytycznych dodatnich pod kątem CD 11 C za pomocą FACS.

Ma to na celu zapewnienie względnie czystej hodowli komórek dendrytycznych do wykorzystania w eksperymentach. W tym przypadku wykorzystujemy system Incucyte firmy SEN Instruments do monitorowania aktywacji komórek dendrytycznych, które w 10. dniu zostały poddane działaniu LPS oraz impulsowi antygenowemu. Niniejsze nagranie obejmuje okres 24 godzin bezpośrednio po dodaniu LPS oraz peptydu; w tym czasie komórki dendrytyczne stają się bardziej aktywne, co objawia się wyraźnymi zmianami morfologicznymi.

Po aktywacji komórek dendrytycznych w impulsie antygenowym, można je ponownie zebrać poprzez inkubację z 300 mM EDTA i wypłukanie płytki. Następnie należy odwirować komórki, dwukrotnie przemyć je 50 ml pożywki RPMI w celu usunięcia nadmiaru antygenu, a następnie oznakować odpowiednim barwnikiem cell tracker. W tym eksperymencie będę obrazować komórki w węźle chłonnym pachwinowym.

Konieczne będzie podskórne wstrzyknięcie od 2 do 5 milionów komórek dendrytycznych w obszar boku myszy pokazanej tutaj. Następnie odczekujemy 24 godziny, aby komórki dendrytyczne mogły przedostać się do węzła chłonnego szkolącego. W tym filmie komórki dendrytyczne są znakowane CMF two hc, niebieskim barwnikiem do śledzenia komórek.

Widoczne są komórki dendrytyczne oddziałujące z oznakowanymi limfocytami T swoistymi dla antygenu volin. Limfocyty T te zostały oznakowane barwnikiem ccf SE. Jako sondy molekularne można również zastosować C-M-T-M-R lub dowolny inny barwnik z serii CellTracker. Przedstawiony etap to wczesna faza aktywacji limfocytów T oddziałujących z komórkami dendrytycznymi.

Ze względu na ich swoistość antygenową widać, że limfocyty T przylegają do wypustek niebiesko znakowanych komórek dendrytycznych. To kończy nasz protokół prezentujący przygotowanie i zastosowanie komórek dendrytycznych szpiku kostnego myszy w eksperymencie obrazowania dwukanałowego. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we własnych eksperymentach.